熒光原位雜交FISH

　熒光原位雜交(fluorescence in situ hybridization,FISH) 是將DNA (或RNA)探針用特殊的核苷酸分子標(biāo)記,按照堿基互補(bǔ)的原則直接雜交結(jié)合到待檢測(cè)染色體或單鏈核酸上，形成可被檢測(cè)的雜交雙鏈核酸。進(jìn)行定性、定位、相對(duì)定量分析。

   FISH技術(shù)優(yōu)勢(shì)：操作簡(jiǎn)單、檢測(cè)快速、結(jié)果易觀察、可檢測(cè)多種類樣品、空間定位準(zhǔn)確、靈敏性和特異性高

   FISH臨床意義：指導(dǎo)臨床治療及藥物選擇、疾病的分期分型及預(yù)后判斷、形態(tài)學(xué)檢測(cè)的輔助手段

熒光原位雜交（FISH）的實(shí)驗(yàn)步驟

   FISH（Fluorescence In-Situ Hybridization）技術(shù)問世于20世紀(jì)70年代后期，是在原來的同位素原位雜交技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)展起來的。其基本原理是，按照兩個(gè)核酸的堿基序列互補(bǔ)原則，用特殊修飾的核苷酸分子標(biāo)記DNA探針，然后將標(biāo)記的探針直接原位雜交到染色體或DNA 纖維切片上，再與熒光素分子偶聯(lián)的單克隆抗體和探針分子特異性結(jié)合，經(jīng)熒光檢測(cè)系統(tǒng)和圖形分析技術(shù)對(duì)染色體或DNA纖維上的DNA序列定位、定性和相對(duì)定量。

試驗(yàn)方法如下：
1）玻片處理
（a）玻片清洗：熱肥皂水刷洗，1%鹽酸浸泡24h，再在0.1%焦炭酸二乙酯（DEPC）中浸泡24h。
（b）硅化處理：玻片和蓋玻片1%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）鹽酸煮沸10min，烘干，錫紙包好4℃保存?zhèn)溆谩?br />（c）明膠涂片制備：將烘干的玻片放入明膠中10min，然后60℃烘干過夜備用。
（d）試劑瓶、塑料器皿及組織勻漿器的處理試劑瓶、組織勻漿器先清洗干凈，用1 mL/LDEPC (Diethyl Pyrocarbonate)水溶液浸泡處理(37℃、2h，室溫過夜)，高壓消毒去除DEPC，然后250℃烘干4h以上或200℃過夜。稱量試劑勺也要干烤。塑料器皿用滅菌的一次性塑料用品，使用前進(jìn)行高壓消毒，為保證質(zhì)量，凡使用的槍頭、試管等均經(jīng)0.5mL/L DEPC水溶液處理3h以上，然后再高壓滅菌，烘干。若為進(jìn)口已處理的無RNase和DNase的槍頭、試管可不必處理直接使用。
（e）各種溶液的配制：凡是水溶性液體均用1mL/L DEPC水配制。
2）樣品制備及其所涉及的試劑包括：
（a）緩沖溶液
   1 X PBS緩沖溶液：NaCl 8g，Na2HPO4 2.9g，KCl 0.2g，KH2PO4 0.2g，溶入1000mL超純水；
   3 X PBS緩沖溶液：NaCl 24g，Na2HPO4 8.7g，KCl 0.6g，KH2PO4 0.6g，溶入1000mL超純水；
   通常配制成10 X PBS的儲(chǔ)備液，3 X PBS和1 X PBS可用DEPC水稀釋獲得。
（b）4%多聚甲醛（Paraformaldehyde, PFA）
   稱取2g PFA加入30ml約60℃的熱水，滴幾滴20% NaOH放在磁力攪拌器攪拌至*溶解。然后向其中加入16.5ml 3 X PBS緩沖液，在冰浴中充分混勻冷卻，冷卻后，用HCl調(diào)整至中性（7.2左右），拿出攪拌子。向PFA溶液中加入超純水，定容在50ml。用0.45微米的膜過濾后使用。（室溫或4℃保存?zhèn)溆茫?br />注意：
   1、配制時(shí)應(yīng)在通風(fēng)條件下操作，并避免接觸皮膚和吸入（戴手套及kou罩），因PFA有較強(qiáng)的固定作用及毒性，對(duì)粘膜及皮膚有固定及毒性，刺激作用；
   2、加熱時(shí)，溫度不宜過高，常為60~65℃，否則，PFA降解失效；
   3、配制好的PFA雖可存放一定時(shí)間，但過久的液體，固定效果下降，應(yīng)盡早使用。
   4% PFA是目前原位雜交組織化學(xué)技術(shù)中常用的固定液，它能較好地保持組織及細(xì)胞內(nèi)的RNA，同時(shí)對(duì)形態(tài)保持也較好。樣品固定時(shí)間在2～3小時(shí)，RNA含量較為恒定。過度延長(zhǎng)固定時(shí)間會(huì)引起細(xì)胞內(nèi)生物大分子的過度交聯(lián)，影響探針的穿透力，降低雜交效率。
（c）配制50%，80%，98%無水乙醇溶液，每個(gè)總量20mL。
（d）DAPI溶液
   用1ml ddH2O將DAPI溶解，制得2.9 mM的DAPI溶液（1mgDAPI/1mL H2O）。（DAPI不能直接用PBS等緩沖液溶解，需要先用水將其溶解）。取適量DAPI水溶液加到PBS中，制備成10～50 uM的DAPI溶液。
3）取樣及保存方法
（a）反應(yīng)器沉淀前取樣2～5mL至離心管。
（b）離心（2000r/min）5min，去上清液（加蒸餾水重復(fù)兩次）。
（c）樣品加入1mL多聚甲醛，搖勻，4℃下放置3h。
（d）樣品離心(12000r/min)5min，去上清夜。
（e）加入1X PBS，搖勻，離心(10000r/min)5min，去上清夜（重復(fù)3次）。
（f）加0.5mL 1X PBS，0.5mL無水乙醇，搖勻，-20℃保存（可保存6個(gè)月）。
4）樣品固定：
   稀釋樣品3～5倍，對(duì)樣品進(jìn)行超聲處理（3W超聲2～3min，沉降1min，去沉淀物，5W超聲5min），將活性污泥絮體打散成單個(gè)細(xì)胞以便于顯微鏡計(jì)數(shù)。然后取3μL樣品涂于包埋明膠的玻片上（檢查樣片本底），37℃的熱烘箱固定2h（或者在空氣中干燥2h或者過夜）。依次用50%、80%、98%（質(zhì)量比）乙醇浸漬3min，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行脫水后，立放，并進(jìn)行干燥。
5）樣品雜交
   試驗(yàn)所涉及的緩沖液包括雜交緩沖液（HybridizationBuffer, HB）和淋洗緩沖液（Washing Buffer, WB），其組分如表1-1和表1-2。
表1-1 雜交緩沖液（Hybridization Buffer）

表1-2淋洗緩沖液（Washing Buffer）

（a）吸取2mL雜交緩沖液遍布在雜交盒內(nèi)折好的吸水紙上，將已固定好樣品的載玻片放入雜交管中，然后在46℃雜交爐中放置數(shù)分鐘。
（b）吸取10 uL探針貯存液和80 uL雜交緩沖液混合后，用箔紙包好放入46℃雜交爐中
預(yù)熱數(shù)分鐘；探針貯存液濃度為25ng/uL，用無菌水稀釋購(gòu)買的探針，實(shí)驗(yàn)用的探針序列及雜交條件見表1-3所示。
表1-3　用于檢測(cè)樣品中AOX、NOX的寡核苷酸探針及雜交條件

注：
（a） 表示雜交緩沖液中去離子甲酰胺濃度（%）
（c）吸取9uL預(yù)熱后的探針稀釋液涂于載玻片待測(cè)樣品上，然后將載玻片迅速地移回雜交管中于46℃下進(jìn)行雜交（黑暗中進(jìn)行），雜交時(shí)間為2～3h；
（d）雜交后的洗脫：打開恒溫水浴槽，加熱到48℃，對(duì)雜交緩沖液、淋洗緩沖液進(jìn)行預(yù)熱。雜交盒中取出載玻片用雜交緩沖液沖洗樣品后，快速放入淋洗緩沖液，48℃水浴20min后用4℃冰水，沖洗樣品，樣品潔凈臺(tái)中揮干。
DAPI染色
   每孔滴9uLDAPI，4℃暗處5min，4℃冰水（BPS緩沖溶液）沖洗，揮干。用帶有360 nm激發(fā)波長(zhǎng)，460nm發(fā)射波長(zhǎng)的濾光片的熒光顯微鏡觀察細(xì)胞。DAPI（4，6-diamido-2-phenylindole）染色用于全細(xì)胞計(jì)數(shù)。
封片
   涂封片劑，蓋蓋玻片，無氣泡后指甲油封裝。
熒光顯微鏡進(jìn)行檢測(cè)
   每個(gè)樣品及每個(gè)探針都采集20個(gè)不同區(qū)域。每個(gè)區(qū)域中的細(xì)胞個(gè)數(shù)要超過1000個(gè)，然后進(jìn)行平均以獲得每個(gè)探針對(duì)于每個(gè)樣品的雜交結(jié)果。細(xì)菌豐度或細(xì)菌數(shù)目（cells/g或cells/L）為AS1/(S2V)，其中A為視野中細(xì)菌平均數(shù)；S1為樣品涂抹面積；S2為視野涂抹面積；V為樣品體積。