細(xì)胞形態(tài)觀察服務(wù)

（一）倒置顯微鏡下直接觀察細(xì)胞形態(tài)

細(xì)胞形態(tài)變化包括：細(xì)胞核、細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)的改變，即細(xì)胞是否有空泡積累和脂質(zhì)小滴、是否可見(jiàn)細(xì)胞膜膨出（鼓泡）、細(xì)胞核染色質(zhì)的變化以及細(xì)胞器如線粒體、溶酶體等的變化、細(xì)胞脫壁和貼壁、細(xì)胞膜表面是否毛糙無(wú)光澤、細(xì)胞是否裂解為碎片等。通過(guò)細(xì)胞形態(tài)的這些變化，可直觀快速地判斷細(xì)胞毒性。

（二）透射電子顯微鏡觀察

【材料】

1. 2％～3％瓊脂糖。

2. 2％～2.5％戊二醛。

3. 1％四氧化*。

4. 0.2M PBS緩沖液。

5．梯度丙酮。分別為50%,70%,90%,100％濃度的丙酮。

【方法】

1．收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的培養(yǎng)細(xì)胞5x107左右。將細(xì)胞連同培養(yǎng)液放入2ml的離心管中，然后用PBS清洗2～3次，1000～1500r/min離心樣品5～10分鐘，吸去上清液，混勻細(xì)胞。

2．沿管壁小心加入2％～2.5％的冷戊二醛，輕輕吹打，使細(xì)胞混勻。在4℃的環(huán)境中固定30分鐘，然后用指彈法將細(xì)胞團(tuán)塊彈散，繼續(xù)用新的固定液固定細(xì)胞30分鐘。1000r/min離心5分鐘，棄上清液。

3．在4℃下用PBS沖洗后放置1～2小時(shí)或者過(guò)夜，離心后棄上清液。

4．管內(nèi)加入0.1～0.5m1 37℃的2％～4％的瓊脂糖液，混勻并冷卻，形成細(xì)胞瓊脂凝膠預(yù)包埋塊。

5．離心管中加入少量的PBS或者75％的乙醇，用鋁片沿管壁小心地將細(xì)胞瓊脂糖松動(dòng)，預(yù)包埋塊移到含有75％乙醇的青霉素瓶中，一天后換固定液一次。4℃保存。

6．將預(yù)包埋塊切成1 mm3大小，放到1％四氧化*中4℃固定1～ 2小時(shí)。用PBS反復(fù)漂洗后放置30分鐘或過(guò)夜。

7．分別用50%,70%,90%,100％的丙酮脫水一次，每次10～15分鐘；然后100％丙酮脫水3次，每次30分鐘。

8．浸入稀釋包埋劑（丙酮：包埋劑=1:1)中，室溫1小時(shí)。再放到純包埋劑中，37℃過(guò)夜。然后60℃固定48小時(shí)。放置于干燥器中備用。

9．將樣品放到電子顯微鏡進(jìn)行透視觀察。

（三）掃描電子顯微鏡觀察

培養(yǎng)細(xì)胞電鏡掃描觀察非常方便；在觀察鐵壁細(xì)胞時(shí)也需要進(jìn)行消化，制備成細(xì)胞懸液后，用Hanks液漂洗1到2次后，除去細(xì)胞碎塊和血清蛋白，以防妨礙觀察。

【材料】

1. 1.5％戊二醛。

2. 0.2M PBS緩沖液。

3. 50%,70%,90%,95%,100％的梯度乙醇。

4. 1％四氧化*（Os04)。

5．丙酮。

【方法】

1．單層細(xì)胞蓋玻片培養(yǎng)物冷漂洗后，用1.5％戊二醛4℃固定1～2小時(shí)。PBS液清洗3次，每次10分鐘。

2．在4℃下用1 % OSO4固定1小時(shí)，然后用PBS緩沖液清洗3次，每次10分鐘。

3．分別用50%,70%,90%,95%,100％的乙醇依次脫水，每個(gè)濃度的乙醇脫水2次，每次15分鐘。

4. 100％丙酮脫水3次，每次30分鐘。

5．將標(biāo)本在4℃下用丙酮保存。

6．用掃描電子顯微鏡觀察。