LabFD AgeI 快速內(nèi)切酶

產(chǎn)品貨號：F3501S

儲存條件：-20℃

同裂酶：AsiGI, CspAI, BshTI, PinAI；（注：同裂酶對于不同的甲基化修飾可能具有不同敏感性。）

產(chǎn)品組成：

產(chǎn)品簡介：

LabFD™ 快速內(nèi)切酶是一系列經(jīng)過基因工程重組的快速限制性內(nèi)切酶，適用于質(zhì)粒 DNA、PCR 產(chǎn)物或基因組 DNA 等的快速酶切。

所有 LabFD AgeI 快速內(nèi)切酶在通用的LabFD™或LabFD™ Color Buffer中都具有優(yōu)良的活性，能夠在 5~15 分鐘內(nèi)完成酶切。此外，蘭博利德去磷酸化、連接試劑在LabFD™ Buffer 中均具有 100% 活性，支持一管化反應(yīng)，提升“酶切-修飾-連接”的體驗。LabFD™ Color Buffer 包括紅色和黃色示蹤染料，可將產(chǎn)物直接用于凝膠電泳。LabFD™ Color Buffer 的紅色染料與 2500 bp 雙鏈DNA 片段在 1% 瓊脂糖凝膠中遷移速率接近；黃色染料與 10 bp雙鏈 DNA 片段在 1% 瓊脂糖凝膠中遷移速率接近。

建議反應(yīng)條件：

1×LabFD™緩沖液；37℃溫育；參照“DNA 快速酶切流程”配制反應(yīng)體系。

失活條件：

80℃溫育 20 min。

質(zhì)量控制

功能活性檢測:

最適反應(yīng)溫度下，在 20ul 反應(yīng)體系中，1ul LabFD™ AgeI 能夠在 15min 內(nèi)wanquan消化 1ug p615 DNA。

超長時間溫育檢測：

最適反應(yīng)溫度下，將 1ul LabFD™ AgeI 與 1ug p615 DNA共同溫育 3h，未檢測到其他核酸酶污染或星號活性引起的底物非特異性降解，延時酶切可能出現(xiàn)星號活性。

酶切-連接-再酶切檢測：

37℃下，使用 10 倍酶量的 LabFD™ AgeI 消化 DNA 底物，回收酶切產(chǎn)物，在 22℃下使用 T4 DNA Ligase (Fast) 可以將超過95% 的酶切產(chǎn)物重新連接。將連接產(chǎn)物再次回收后，使用相同的內(nèi)切酶可以重新切開 95% 以上的連接產(chǎn)物。

非特異性內(nèi)切酶活性檢測：

最適反應(yīng)溫度下，將 1ul LabFD™ AgeI 與 1ug 超螺旋質(zhì)粒 DNA 共同溫育 4h，使用瓊脂糖凝膠電泳檢測，質(zhì)粒 DNA 仍然處于超螺旋狀態(tài)。

藍(lán)白斑檢測

使用 1μl  LabFD™ AgeI消化含有 lacZα 基因且僅在該基因上具有1個酶切位點的特定載體。將酶切產(chǎn)物重新連接后轉(zhuǎn)化到大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞中，涂布在含有X-gal、IPTG 和相應(yīng)抗生素的LB平板培養(yǎng)基上生長。成功連接的β-半乳糖苷酶基因可以正確表達(dá)，并生長出藍(lán)色菌落；而因酶切末端降解等原因未能重新連接的產(chǎn)物將得到白色菌落。對于 LabFDTM 系列限制酶而言，白色菌落的比例應(yīng)當(dāng)小于 1%。

使用方法：

1. DNA 快速酶切流程（1）在冰上按如下建議的加樣順序配制反應(yīng)體系：

2. 
   

a. 本體系適用于經(jīng)過純化的 PCR 產(chǎn)物酶切。未純化的 PCR 產(chǎn)物具備一定的離子強(qiáng)度，10× LabFD™ Buffer 加入量可適當(dāng)減少至2μl。但由于DNA 聚合酶同時具有外切酶活性，會影響酶切產(chǎn)物，因此如下一步需進(jìn)行克隆等操作，建議酶切前對PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化；

（2）輕柔吸打或輕彈管壁以混勻（切勿渦旋），然后瞬時離心以收集掛壁液滴；

（3）37℃溫育 15min（質(zhì)粒），或 15~30min（PCR 產(chǎn)物），或 30~60min（基因組 DNA）；

（4）80℃溫育 20min 即可使酶失活，停止反應(yīng)（可選）；

（5）如果使用 LabFD™ Color Buffer 進(jìn)行酶切反應(yīng)，得到的產(chǎn)物可以直接進(jìn)行上樣電泳。

2.雙酶切或多酶切

（1）每種快速內(nèi)切酶的用量為 1ul，并根據(jù)需要適當(dāng)擴(kuò)大反應(yīng)體系；

（2）所有快速內(nèi)切酶的體積總和不得超過總反應(yīng)體系的 1/10；

（3）如果所用的幾種快速內(nèi)切酶的最適反應(yīng)溫度不同，應(yīng)先以最適溫度低的酶開始酶切，再添加最適溫度較高的酶，在其最適反應(yīng)溫度下進(jìn)行酶切反應(yīng)。

3.適用于質(zhì)粒的擴(kuò)大反應(yīng)體系

注：如果總反應(yīng)體系大于 20ul，應(yīng)適當(dāng)增加溫育時間，盡量使用水浴、金屬浴或沙浴。

不同 DNA 中的酶切位點數(shù)量

甲基化修飾影響

在不同反應(yīng)緩沖液中的活性

注：活性數(shù)據(jù)來自 LABLEAD 限制酶標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)體系下的檢測。