Invitrogen™ TRIzol™ 試劑

賽默飛 TRIzol 試劑是一種即用型試劑，該和 Guanidine isothiocyanate 的單相溶液設(shè)計(jì)用于在1小時(shí)內(nèi)從人類、動(dòng)物、植物、酵母或細(xì)菌來(lái)源的細(xì)胞和組織樣本中提取高質(zhì)量的總RNA（以及DNA和蛋白質(zhì)），TRIzol試劑在樣本勻漿化時(shí)，可以破壞細(xì)胞，溶解細(xì)胞組分，同時(shí)高效的抑制RNA酶的活性，從而維持RNA的完整性。

TRIzol™ 試劑的主要特點(diǎn)包括：

? 可從同一樣品中分離 RNA、DNA 和蛋白
? 擁有的裂解能力，甚至可處理困難的樣品類型（CN）₂
? 針對(duì)組織、細(xì)胞、血清、病毒和細(xì)菌進(jìn)行優(yōu)化的配方和方案

從多種樣品體積和來(lái)源中可靠純化 RNA
TRIzol™ 試劑可很好地處理少量組織 (50–100 mg) 和細(xì)胞 (5 × 10⁶) 以及大量組織 (≥1 g) 和細(xì)胞 (>10⁷)，且包含用于從人、動(dòng)物、植物或細(xì)菌來(lái)源的樣品中進(jìn)行純化的方案。TRIzol™ 試劑通過(guò)在樣品均質(zhì)化期間高效抑制 RNase 活性維持 RNA 的完整性，同時(shí)破壞細(xì)胞并溶解細(xì)胞組分。TRIzol™ 試劑方法的簡(jiǎn)單性使其可同時(shí)處理大量樣品。可在不到 1 小時(shí)的時(shí)間內(nèi)完成整個(gè)程序。通過(guò) TRIzol™ 試劑分離的總 RNA 不含蛋白和 DNA 污染。

其配方可分離多種分子靶標(biāo)
TRIzol™ 試劑可使您連續(xù)沉淀單份樣品中的 RNA、DNA 和蛋白。使用 TRIzol™ 試劑均質(zhì)化樣品后，加入氯仿，使勻漿分離成透明的上層水層（含 RNA）、中間相和紅色下層有機(jī)層（含 DNA 和蛋白）。使用異丙醇從水層中沉淀出 RNA。使用乙醇從中間相/有機(jī)層中沉淀出 DNA。通過(guò)異丙醇沉淀從-乙醇上清液中沉淀出蛋白。將沉淀出的 RNA、DNA 或蛋白洗滌以去除雜質(zhì)，然后重懸以用于下游應(yīng)用。

TRIzol 使用必學(xué)小妙招

準(zhǔn)備階段：

1. 確保實(shí)驗(yàn)環(huán)境無(wú)核酸酶污染，可以使用 RNaseZap™ RNase 去污溶液（貨號(hào) AM9780）去除實(shí)驗(yàn)臺(tái)表面和非一次性物品。

2. 實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，請(qǐng)使用一次性手套和不含核酸酶的一次性槍頭和離心管，防止引入核酸酶污染。

3. 準(zhǔn)備好相應(yīng)的實(shí)驗(yàn)材料：

a. 提取 RNA：異丙醇，乙醇（75%），0.5% SDS 溶液。

b. 提取 DNA：乙醇（99%），乙醇（75%），0.1 M檸檬酸鈉溶于 10% 乙醇，8 mM NaOH，HEPES。

c. 提取蛋白質(zhì)：異丙醇，乙醇（99%），含 0.3 M 鹽酸胍的 95% 乙醇，1% SDS 溶液。

tips

實(shí)驗(yàn)環(huán)境和實(shí)驗(yàn)用品的核酸酶污染是導(dǎo)致 RNA 實(shí)驗(yàn)失敗的重要因素，做好核酸酶清除工作，使用無(wú)核酸酶的實(shí)驗(yàn)用品，可以讓我們實(shí)驗(yàn)事半功倍哦！

實(shí)驗(yàn)步驟：

裂解樣本

1. 根據(jù)不同樣本材料在 TRIzol 試劑中裂解并勻漿化樣本。

a. 組織：每 50～100 mg 組織加入 1 mL TRIzol 試劑，用勻漿儀對(duì)樣本進(jìn)行勻漿化。

b. 單層培養(yǎng)細(xì)胞：移除培養(yǎng)基，每 1×10⁵～10⁷個(gè)細(xì)胞加入 0.3～0.4 mL TRIzol 試劑，反復(fù)吹打勻漿化樣本。

c. 細(xì)胞懸液：離心后棄除上清液，收集細(xì)胞，每 0.25 mL 樣本加 0.75 mL 的 TRIzol 試劑，反復(fù)吹打以勻漿化。

tips

1）在 TRIzol 試劑中可以防止 RNA 降解，故加入 TRIzol 試劑前，不要洗滌細(xì)胞。

2）樣本體積不應(yīng)超過(guò)用于裂解的 TRIzol 試劑體積的 10%。

2. 孵育 5 分鐘，隨后每 1 mL TRIzol 試劑添加 0.2 mL 氯仿，蓋緊蓋子，劇烈混勻。孵育 2~3 分鐘。4℃ 下 12,000×g 離心 15 分鐘。

3. 此時(shí)混合物分離成為三層，如下圖，我們需要將對(duì)應(yīng)提取部分吸出進(jìn)行后續(xù)操作。

tips

Invitrogen™ Phasemaker 分層管（貨號(hào)：A33248，A33249）可在 TRIzol 混合物樣品的水相和有機(jī)相間形成一層牢固可靠的膠封，使科研人員能夠輕松移取 RNA 相。

RNA 提取

1. RNA 沉淀：取盡上層水相，每 1 mL TRIzol 試劑加 0.5 mL 異丙醇。4℃ 孵育10分鐘。4℃ 下 12,000×g 離心 10 分鐘。此時(shí)底部的白色膠狀沉淀即為總 RNA 沉淀。棄上清液。

2. RNA 洗滌：每 1 mL 用于裂解的 TRIzol 試劑，用 1 mL 75% 乙醇重懸沉淀。瞬時(shí)漩渦震蕩，在 4℃ 下 7,500×g 離心 5 分鐘。棄上清，RNA 沉淀在空氣中干燥 5～10 分鐘。

3. RNA 溶解：用 20～50 μL 不含 RNase 的水，0.1 mM EDTA 或 0.5% SDS 溶液，反復(fù)吹打重懸沉淀。在 55～60℃ 孵育 10～15 分鐘，然后繼續(xù)下游實(shí)驗(yàn)或者 -70℃ 長(zhǎng)期保存。

tips

1）如果起始樣本很?。? 10⁶ 個(gè)細(xì)胞或 < 10 mg 組織），請(qǐng)將 5～10 μg 不含 RNase 的糖原作為載體加入到水相中，這樣有助于促進(jìn) RNA 沉淀。

2）如果 RNA 會(huì)在隨后的酶促反應(yīng)中使用，則切勿將 RNA 溶解在 0.5% SDS 溶液中。

DNA 提取

1. DNA 沉淀：棄除上層水相，剩余相中每 1 mL 用于裂解的 TRIzol 試劑添加 0.3 mL 99% 乙醇，蓋緊管蓋，反復(fù)顛倒混勻。孵育 2～3 分鐘。4℃ 下 2,000×g 離心 5 分鐘，沉淀 DNA，移除溶有蛋白質(zhì)的上清液。

2. DNA 洗滌：每 1 mL 用于裂解的 TRIzol 試劑加 1 mL 含 10% 乙醇的 0.1 M 檸檬酸鈉（pH 8.5）重懸沉淀。孵育 30 分鐘，偶爾輕輕顛倒混合。4℃ 下 2,000×g 離心 5 分鐘，棄上清液。重復(fù)洗滌步驟一次。對(duì)于 DNA 含量較大的樣本（＞ 200 μg）可以重復(fù)洗滌步驟兩次。每 1 mL 用于裂解的TRIzol試劑加入 1.5～2 mL 75% 乙醇重懸沉淀，孵育 10～20 分鐘，偶爾輕輕顛倒混合。4℃ 下 2,000×g 離心 5 分鐘，棄上清液，沉淀風(fēng)干 5～10 分鐘。

3. DNA 溶解：用 0.3～0.6 mL 的 8 mM NaOH 上下吹打重懸沉淀，4℃ 下 12,000×g 離心 10 分鐘，轉(zhuǎn)移上清至新管子中。加 HEPES 調(diào)整 PH 用于下游應(yīng)用或用 HEPES 和 1 mM EDTA 調(diào)節(jié) PH 至 7～8 長(zhǎng)期存儲(chǔ)于 -20℃。

tips

干燥 DNA 的時(shí)候，不要用真空離心干燥，會(huì)影響 DNA 質(zhì)量以及后續(xù) DNA 溶解。

蛋白質(zhì)提取

1. 蛋白質(zhì)沉淀：棄除上層水相，剩余相中每 1 mL  用于裂解的 TRIzol 試劑添加 0.3 mL 99% 乙醇，蓋緊管蓋，反復(fù)顛倒混勻。孵育 2～3 分鐘。4℃ 下 2,000×g 離心 5 分鐘，沉淀 DNA。上清轉(zhuǎn)移至新管中，每 1 mL 用于裂解的 TRIzol 試劑加 1.5 mL 異丙醇，孵育 10 分鐘。在 4℃ 下 12,000×g 離心 10 分鐘，棄上清液，留蛋白質(zhì)沉淀。

2. 蛋白質(zhì)洗滌：每 1 mL 用于裂解的 TRIzol 試劑需要加 2 mL 的含 0.3 M 鹽酸胍的 95% 乙醇至沉淀中，孵育 20 分鐘。在 4℃ 下 7,500×g 離心 5 分鐘。棄上清液，沉淀在干燥空氣中靜置 5～10 分鐘。

3. 蛋白質(zhì)溶解：加入 200 μL 1% SDS 溶液，反復(fù)吹打重懸。4℃ 下 10,000×g 離心 10 分鐘，將上清轉(zhuǎn)移到新管中。檢測(cè)蛋白質(zhì)濃度并用于下游應(yīng)用或者長(zhǎng)期存儲(chǔ)與 -20℃ 中。

tips 

蛋白質(zhì)溶解步驟中的重懸，在 50℃ 水浴或者金屬浴中孵育，有助于沉淀重懸充分。