人嗜酸性粒細(xì)胞陽離子蛋白(EC

人嗜酸性粒細(xì)胞陽離子蛋白(ECP)ELISA試劑盒檢測原理： 

試劑盒采用雙抗體一步夾心法酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）。往預(yù)先包被顆粒酶B（Gzms-B）抗體的包被微孔中，依次加入標(biāo)本、標(biāo)準(zhǔn)品、HRP標(biāo)記的檢測抗體，經(jīng)過溫育并洗滌。用底物TMB顯色，TMB在過氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成最終的黃色。顏色的深淺和樣品中的顆粒酶B（Gzms-B）呈正相關(guān)。用酶標(biāo)儀在450nm波長下測定吸光度（OD值），計(jì)算樣品濃度。  

人嗜酸性粒細(xì)胞陽離子蛋白(ECP)ELISA試劑盒樣品收集、處理及保存方法：  

1.血清：使用不含熱原和內(nèi)毒素的試管，操作過程中避免任何細(xì)胞刺激，收集血液后，3000轉(zhuǎn)離心10分鐘將血清和紅細(xì)胞迅速小心地分離。  

2.血漿：EDTA、檸檬酸鹽或肝素抗凝。3000轉(zhuǎn)離心30分鐘取上清。  

3.細(xì)胞上清液：3000轉(zhuǎn)離心10分鐘去除顆粒和聚合物。  

4.組織勻漿：將組織加入適量生理鹽水搗碎。3000轉(zhuǎn)離心10分鐘取上清。  

5.保存：如果樣本收集后不及時(shí)檢測，請按一次用量分裝，凍存于-20℃，避免反復(fù)凍融，在室溫下解凍并確保樣品均勻地充分解凍。  

自備物品  

酶標(biāo)儀（450nm）  

高精度加樣器及槍頭：0.5-10uL、2-20uL、20-200uL、200-1000uL  

37℃恒溫箱  

操作注意事項(xiàng)：  

試劑盒保存在2-8℃，使用前室溫平衡20分鐘。從冰箱取出的濃縮洗滌液會有結(jié)晶，這屬于正?，F(xiàn)象，水浴加熱使結(jié)晶溶解后再使用。  

實(shí)驗(yàn)中不用的板條應(yīng)立即放回自封袋中，密封（低溫干燥）保存。  

濃度為0的S0號標(biāo)準(zhǔn)品即可視為陰性對照或者空白；按照說明書操作時(shí)樣本已經(jīng)稀釋5倍，最終結(jié)果乘以5才是樣本實(shí)際濃度。  

嚴(yán)格按照說明書中標(biāo)明的時(shí)間、加液量及順序進(jìn)行溫育操作。  

所有液體組分使用前充分搖勻。  

試劑盒組成： 

注：標(biāo)準(zhǔn)品（S0-S5）濃度依次為：0、1、2、4、8、16pg/mL 。 

試劑的準(zhǔn)備：  

20×洗滌緩沖液的稀釋：蒸餾水按1：20稀釋，即1份的20×洗滌緩沖液加19份的蒸餾水。  

洗板方法：  

手工洗板：甩盡孔內(nèi)液體，每孔加滿洗滌液，靜置1min后甩盡孔內(nèi)液體，在吸水紙上拍干，如此洗板5次。  

自動(dòng)洗板機(jī)：每孔注入洗液350μL，浸泡1min，洗板5次。  

操作步驟：  

從室溫平衡20min后的鋁箔袋中取出所需板條，剩余板條用自封袋密封放回4℃。  

設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣本孔，標(biāo)準(zhǔn)品孔各加不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品50μL。

樣本孔先加待測樣本10μL，再加40μL；空白孔不加。  

除空白孔外，標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣本孔中每孔加入辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的檢測抗體100μL，用封板膜封住反應(yīng)孔，37℃水浴鍋或恒溫箱溫育60min。  

棄去液體，吸水紙上拍干，每孔加滿洗滌液，靜置1min，甩去洗滌液，吸水紙上拍干，如此重復(fù)洗板5次（也可用洗板機(jī)洗板）。  

每孔加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育15min。  

每孔加入終止液50μL，15min內(nèi)，在450nm波長處測定各孔的OD值。  

結(jié)果判斷： 

繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線：在Excel工作表中，以標(biāo)準(zhǔn)品濃度作橫坐標(biāo)，對應(yīng)OD值作縱坐標(biāo)，繪制出標(biāo)準(zhǔn)品線性回歸曲線，按曲線方程計(jì)算各樣本濃度值。  

試劑盒性能：  

準(zhǔn)確性：標(biāo)準(zhǔn)品線性回歸與預(yù)期濃度相關(guān)系數(shù)R值，大于等于0.9900。  

靈敏度：檢測濃度小于0.1pg/mL。  

特異性：不與其它可溶性結(jié)構(gòu)類似物交叉反應(yīng)。  

重復(fù)性：板內(nèi)、板間變異系數(shù)均小于15%。  

貯藏：2-8℃，避光防潮保存。  

有效期：6個(gè)月。