CA9418 Calcein-AM/PI活細(xì)胞/死細(xì)胞雙染試劑盒檢測(cè)

NobleRyder CA9418 Calcein-AM/PI活細(xì)胞/死細(xì)胞雙染試劑盒Calcein-AM/PI，Live/Dead Cell Double Stain Kit

產(chǎn)品貨號(hào)：CA9418

產(chǎn)品名稱：Calcein-AM/PI活細(xì)胞/死細(xì)胞雙染試劑盒Calcein-AM/PI，Live/Dead Cell Double Stain Kit

英文名稱：Calcein-AM/PI，Live/Dead Cell Double Stain Kit

產(chǎn)品規(guī)格：500T

Calcein-AM/PI活細(xì)胞/死細(xì)胞雙染試劑盒檢測(cè)

產(chǎn)品簡(jiǎn)介：

儲(chǔ)存條件：-20℃，避光，有效期1年。

具體產(chǎn)品的參數(shù)以收到產(chǎn)品說(shuō)明書的參數(shù)為準(zhǔn)

NobleRyder CA9418 Calcein-AM/PI活細(xì)胞/死細(xì)胞雙染試劑盒Calcein-AM/PI，Live/Dead Cell Double Stain Kit是一種對(duì)活細(xì)胞進(jìn)行熒光標(biāo)記的細(xì)胞染色試劑，發(fā)綠色熒光（Ex=490nm,Em=515nm）。因其在傳統(tǒng)的Calcein（鈣黃綠素）基礎(chǔ)上引入yi酰甲氧基甲酯（AM）基團(tuán)，增加了疏水性，使其能夠輕易穿透活細(xì)胞膜。一旦進(jìn)入細(xì)胞后，Calcein-AM（本身不發(fā)熒光）被細(xì)胞內(nèi)的酯酶剪切形成膜非滲透性的極性分子Calcein，從而被滯留在細(xì)胞內(nèi)并發(fā)出強(qiáng)綠色熒光。與其它同類試劑（如BCECF-AM和CFDA)相比，由于Calcein,AM細(xì)胞毒性極低，是最shi合用于活細(xì)胞染色的熒光探針，而且不會(huì)抑制任何的細(xì)胞功能，如增殖和淋巴球的趨化性。

由于死細(xì)胞缺乏酯酶，Calcein-AM僅用于對(duì)活細(xì)胞的細(xì)胞生存能力測(cè)試和短期標(biāo)記。因此，Calcein-AM 常常與死細(xì)胞熒光探針如碘化bing啶（PI）等聯(lián)合使用，同時(shí)進(jìn)行活細(xì)胞和死細(xì)胞的熒光雙重染色。碘化bing啶（Propidiumiodide，PI）不能穿過(guò)活細(xì)胞的細(xì)胞膜，僅能穿過(guò)死細(xì)胞膜的無(wú)序區(qū)域而到達(dá)細(xì)胞核，并嵌入細(xì)胞的DNA雙螺旋從而產(chǎn)生紅色熒光（Ex=535nm,Em=617nm），因此PI 僅對(duì)死細(xì)胞染色。由于Calcein和PI-DNA都可被490nm激發(fā)，因此可用熒光顯微鏡同時(shí)觀察活細(xì)胞和死細(xì)胞。而用545nm激發(fā)，僅可觀察到死細(xì)胞。

本試劑盒的工作原理就在于Calcein-AM和PI的雙重染料，來(lái)進(jìn)行活細(xì)胞和死細(xì)胞的雙重染色標(biāo)記，從而進(jìn)行活細(xì)胞和死細(xì)胞水平的分析。根據(jù)我司優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)體系，單次就100µL細(xì)胞懸液進(jìn)行染色，可以做500次檢測(cè)。

使用方法（僅供參考）：

1. 工作液的前處理

(1) 從低溫冰箱內(nèi)取出10×AssayBuffer，根據(jù)單次用量無(wú)菌條件取出適量，用去離子水10倍稀釋以得到1×AssayBuffer。

(2) 由于Calcein-AM 的穩(wěn)定性受溫度影響較大，建議收到貨后，可分裝為小份，密封避光保存于-20℃，不能反復(fù)凍融。若染色液經(jīng)稀釋，建議當(dāng)天用完。

2. 細(xì)胞處理

(1) 懸浮生長(zhǎng)的細(xì)胞，收集至離心管，450g ，離心5min，去除上清。用1x的AssayBuffer洗滌細(xì)胞，450g，離心5min，2次，去除殘留酯酶。

(2) 貼壁細(xì)胞經(jīng)0.25%yi酶-EDTA消化后，收集細(xì)胞，用1x的AssayBuffer洗滌細(xì)胞，450g，離心5min，2次，去除yi酶及殘留的酯酶。

3. 染色步驟

(1) 離心得到的細(xì)胞沉淀用1×AssayBuffer重懸，使重懸后細(xì)胞懸液計(jì)數(shù)細(xì)胞量為1×105~6個(gè)/ml。

(2) 每1ml的細(xì)胞量加入1-2ul的Calcein-AM（原液），吹打混勻，37℃避光孵育 20min-25min。

(3) 將試劑盒自帶的PI原液取3-5ul加入上述染色細(xì)胞中，室溫避光染色5min。

(4) 孵育熒光后的細(xì)胞，450g，5min，離心去除染色液。

注：細(xì)胞進(jìn)行熒光染色時(shí)建議全程避光。

(5) 用1x的PBS清洗細(xì)胞450g，5min，離心后用1xPBS重懸細(xì)胞，取3-5ul滴在潔凈的載玻片上，用干凈的蓋玻片壓片后，請(qǐng)及時(shí)熒光鏡檢。

(6)  熒光顯微鏡下使用490±10nm激發(fā)濾片同時(shí)檢測(cè)活細(xì)胞（黃綠色熒光）以及死細(xì)胞（紅色熒光）。另外，使用545nm的發(fā)射濾片僅能觀察到死細(xì)胞。也可以直接在熒光酶標(biāo)儀下使用合適的濾片進(jìn)行檢測(cè)。

注意事項(xiàng)：

(1) 為了您的安全和健康，請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。

(2) 貼壁細(xì)胞也可以不消化，直接去除培養(yǎng)基，經(jīng)1×AssayBuffer浸洗2min，2次。按上述細(xì)胞量和染色液濃度比例進(jìn)行染色，染色時(shí)間和染色液工作濃度可按實(shí)際檢測(cè)調(diào)整。

(3) Calcein-AM 作用于細(xì)胞，一般細(xì)胞量在1×105-6個(gè)時(shí)，Calcein-AM的工作濃度基本在2-4µM（如遇鏡檢熒光亮度過(guò)強(qiáng)，稀釋比例可適當(dāng)調(diào)整在1:500到1:2000或更大）；PI的工作濃度在5µM左右。但由于不同細(xì)胞系的優(yōu)良染色條件不同，初次實(shí)驗(yàn)建議做梯度實(shí)驗(yàn)，以確定 Calcein-AM和PI的最適濃度。梯度篩選的原則為使用最di的探針濃度得到最hao的熒光結(jié)果。

(4) 碘化丙啶（PI）有一定的致癌性，操作時(shí)一定要注意防護(hù)。若接觸到皮膚，需要立即用自來(lái)水清洗。

注：可以使用以下方法來(lái)優(yōu)化得到兩種熒光染料針對(duì)不同細(xì)胞的優(yōu)良工作濃度。

a) 用0.1%皂素或者0.1-0.5%地gao辛孵育細(xì)胞10min，或者用70%乙醇孵育細(xì)胞30min，從而制備死細(xì)胞；

b) 用0.1-10µM的PI溶液進(jìn)行死細(xì)胞染色，以得到僅僅對(duì)細(xì)胞核染色，而不會(huì)對(duì)細(xì)胞質(zhì)染色的優(yōu)良工作濃度。

c) 用0.1-10µM 的Calcein-AM 進(jìn)行死細(xì)胞染色，以得到不會(huì)對(duì)細(xì)胞質(zhì)染色的優(yōu)良工作濃度。然后用此濃度進(jìn)行活細(xì)胞染色，去觀察是否活細(xì)胞能被染色。

Calcein-AM/PI活細(xì)胞/死細(xì)胞雙染試劑盒檢測(cè) 

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