Top-Down蛋白質(zhì)組學(xué)流程全解析

Top-Down蛋白質(zhì)組學(xué)流程全解析檢測技術(shù)服務(wù)詳情介紹

Top-Downdànbáizhì組學(xué)（Top-Down Proteomics, TDP）是一種直接分析完整dànbáizhì（intact proteins）的方法，與之相對的是Bottom-Up dànbáizhì組學(xué)，它通過dànbáizhì的酶解產(chǎn)物（通常是肽段）來進(jìn)行鑒定和定量。Top-Down 方法可以在保持dànbáizhì原始狀態(tài)的同時，更全面地揭示其翻譯后修飾（PTMs）、亞型（proteoforms）等信息。Top?Down dànbáizhì組學(xué)可為科研人員提供zuì貼近真實(shí)蛋白形態(tài)的深度解析，是功能dànbáizhì組學(xué)、標(biāo)志物研究和新藥靶點(diǎn)開發(fā)中的利器。

一、樣品制備

1、樣本來源與質(zhì)量控制

（1）組織 / 細(xì)胞：使用冷凍研磨或顯微切割獲取高純度樣品

（2）血清 / 血漿：通過去除高豐度蛋白增強(qiáng)低豐度蛋白檢測

（3）重組蛋白 / 標(biāo)準(zhǔn)品：用于方法開發(fā)、定量驗(yàn)證

關(guān)鍵在于完整性保護(hù)：采用低溫操作、防蛋白酶處理、迅速冷凍，防止蛋白降解與修飾丟失。

2、分離預(yù)處理

（1）脫鹽 / 除雜：通過凝膠過濾或透析去除鹽離子干擾

（2）濃縮 / 緩沖切換：確保離子化兼容性

二、分離系統(tǒng)

Top-Downdànbáizhì組學(xué)分析前需進(jìn)行高效分離以減少干擾，常用包括：

1、反相液相色譜（RP?HPLC）

適用于保守性較強(qiáng)的小至中型蛋白（<30?kDa）。優(yōu)化梯度使完整蛋白以圓滑峰形進(jìn)入質(zhì)譜。

2、 正相 / 離子交換色譜（IEX）

可根據(jù)蛋白電荷狀態(tài)分級，增強(qiáng)復(fù)雜樣品中蛋白覆蓋。

3、毛細(xì)管電泳（CIEF / CZE）

在電場作用下分離等電點(diǎn)蛋白，適用于高度同分異構(gòu)體分析。

三、離子化與質(zhì)譜檢測

1、 離子化方式

（1）ESI（電噴霧電離）：多電荷離子適合大分子

（2）MALDI：優(yōu)點(diǎn)是快速，但Top?Down應(yīng)用受限

2、 質(zhì)譜儀平臺

（1）Orbitrap Eclipse/HF-X：高分辨率（>120,000），質(zhì)譜準(zhǔn)確度高

（2）FT-ICR：亞ppm精度，可解析高度同位素峰

（3）QB/TimSTOF：融合QB碎裂技術(shù)，適合翻牌蛋白分析

四、dànbáizhì碎裂策略

完整蛋白需要高效碎裂才能鑒定其一級序列及修飾。常見片段如下：

1、ECD（電子捕獲解離）

羧基保留能力強(qiáng)，適合定位磷酸化、糖基化等PTMs，其特點(diǎn)是 back?bone 裂解突出 c/z 離子。

2、ETD（電子轉(zhuǎn)移解離）

類似 ECD、能處理較高價(jià)帶蛋白，兼具高通量適用性。

3、 CID / HCD（碰撞誘導(dǎo)解離）

常用于小到中等分子量蛋白的序列確認(rèn)，但可能導(dǎo)致易失性修飾脫落，如磷酸基團(tuán)。

4、UVPD（紫外光解離）等gāojí方法

提供a+x片段，序列覆蓋更完整，修飾位置更jīngquè。

整合建議：《Top?Down 實(shí)驗(yàn)流程圖》中，推薦“主碎裂方法選擇 + 輔助方法組合”性策略，提升覆蓋率。

五、數(shù)據(jù)采集與實(shí)時分析

現(xiàn)代儀器支持 DIA（Data?Independent Acquisition）和 DDA（Data?Dependent Acquisition）：

1、DDA：針對前體離子碎裂，有高靈敏度，但通量有限

2、DIA：按窗口無選擇掃全片段，通量高但譜圖復(fù)雜

六、Top-Downdànbáizhì組學(xué)數(shù)據(jù)處理與結(jié)果解析

1、預(yù)處理

（1）去噪、脫譜、重建同位素包：

（2）軟件：Thermo ProSight PTM、TopPIC、TDPortal、MSPathFinder

2、序列匹配與 PTM 定位

（1）比對預(yù)設(shè)譜圖庫或 de novo

（2）可識別磷酸化、甲基化、乙?；任稽c(diǎn)

（3）標(biāo)記“wánquán蛋白+PTM+剪切”的 proteoform 信息

3、定量 / 差異分析

（1）峰面積或基于標(biāo)記法（如 TMT）進(jìn)行相對定量

（2）結(jié)合統(tǒng)計(jì)分析檢驗(yàn)顯著性

4、結(jié)果可視化

（1）峰圖覆蓋度、譜圖可視化展示、Proteoform 圖譜

（2）修飾熱圖、Protein network整合等

七、應(yīng)用領(lǐng)域拓展

1、生物標(biāo)志物發(fā)現(xiàn)：腫瘤、神經(jīng)退行性疾病中特定 proteoform 挖掘

2、藥物靶標(biāo)驗(yàn)證：大分子藥物結(jié)合誘導(dǎo) PTM 變化檢測

3、合成生物 / 重組dànbáizhì量控制：質(zhì)量一致性與結(jié)構(gòu)驗(yàn)證

4、異構(gòu)體功能分析：不同剪切變體下的組織特異性功能研究

八、百泰派克Top-Downdànbáizhì組學(xué)特點(diǎn)

1、平臺優(yōu)勢：Orbitrap Eclipse + ETD/ECD/MS/MS 專用碎裂單元

2、流程體系：涵蓋從樣本到深度數(shù)據(jù)解析的全流程，一站式服務(wù)

3、定制支持：支持bǎxiàngdàn白定向方法開發(fā)（PTM、剪切異構(gòu)體、高分子蛋白）

4、結(jié)果報(bào)告：提供 Proteoform 識別表格、序列修飾圖譜、定量分析熱圖、網(wǎng)絡(luò)圖、技術(shù)可重復(fù)性評價(jià)

百泰派克生物科技憑借優(yōu)良儀器、zhuānyè團(tuán)隊(duì)和系統(tǒng)化流程，致力為生命科學(xué)領(lǐng)域客戶提供jíjù價(jià)值的Top-Downdànbáizhì組學(xué)解決方案。

百泰派克生物科技特色項(xiàng)目

一、蛋白測序

百泰派克生物科技使用Thermo公司新推出的Obitrap Fusion Lumos質(zhì)譜儀及島津公司埃德曼降解測序系統(tǒng)對dànbáizhì序列進(jìn)行分析，提供基于質(zhì)譜的蛋白測序分析服務(wù)，包括對dànbáizhì的氨基酸組成分析，Nduāncèxù，Cduāncèxù和全序列分析，以及基于埃德曼降解的dànbáizhìN端序列分析服務(wù)。對于未知理論序列的dànbáizhì，提供基于從頭測序法的dànbáizhì從頭測序服務(wù)，對蛋白序列進(jìn)行分析。

※服務(wù)優(yōu)勢：

1.采用目前世界上優(yōu)良的質(zhì)譜儀器 Obitrap Fusion Lumos;

2.可實(shí)現(xiàn)對所測定靶蛋白序列 100% 的覆蓋;

3.可測定蛋白N端多達(dá) 70個氨基酸序列;

4.可測定多種形式的樣品: 蛋白溶液、PVDF 蛋白條帶;

5.樣品用量低: 蛋白樣品僅需 5-10ug，即可完成檢測;

6.測序不受N端封閉，PEC和和糖基化等N端修飾的影響。

二、dànbáizhì組學(xué)

百泰派克生物科技采用Thermo Fisher的Orbitrap Fusion Lumos質(zhì)譜平臺結(jié)合Nano-LC，提供定量dànbáizhì組學(xué)、靶向dànbáizhì組學(xué)、多肽組學(xué)、翻譯后修飾蛋白組學(xué)等多種dànbáizhì組學(xué)分析服務(wù)。此外，百泰派克生物科技新推出基于timsTOF Pro的4Ddànbáizhì組學(xué)服務(wù)，助力微量樣本蛋白組學(xué)、大樣本群醫(yī)學(xué)及高通量修飾組學(xué)等研究工作。

※服務(wù)優(yōu)勢：

1 .高通量定量蛋白分析:多對照組大規(guī)模實(shí)驗(yàn)分析，發(fā)現(xiàn)新的生物標(biāo)記物;

2.體內(nèi)體外多種dànbáizhì標(biāo)記方法，適用于分析組織、細(xì)胞、血液等多種樣品;

3.質(zhì)譜分析靈敏度高，實(shí)驗(yàn)結(jié)果重復(fù)度高;

4.可檢測較低豐度蛋白，線性范圍廣;

5.zhuānyè生物信息學(xué)分析，分析更系統(tǒng)準(zhǔn)確。

三、單細(xì)胞質(zhì)譜流式技術(shù)分析

百泰派克生物科技采用Fluidigm質(zhì)譜流式系統(tǒng)進(jìn)行單細(xì)胞質(zhì)譜流式技術(shù)分析，采用金屬元素標(biāo)記物（通常是金屬元素標(biāo)記的特異抗體）標(biāo)記細(xì)胞表面和內(nèi)部的分子，然后用流式細(xì)胞原理分離單個細(xì)胞，再用電感耦合等離子體質(zhì)譜（ICP-MS）分析單個細(xì)胞的原子質(zhì)量譜，zuì后將原子質(zhì)量譜數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換為細(xì)胞表面和內(nèi)部的信號分子表達(dá)量。

※服務(wù)優(yōu)勢：

1.技術(shù)優(yōu)良，*技術(shù)空白

采用金屬標(biāo)記抗體技術(shù)，避免了傳統(tǒng)流式熒光通道少且易相互影響的問題。可在單細(xì)胞層面上對多種指標(biāo)同時進(jìn)行表征，百泰派克生物科技可做到同時檢測51個目標(biāo)蛋白。

2.分析數(shù)量大，成本較低

單細(xì)胞RNAseq受成本等因素限制，所有樣本細(xì)胞匯總的分析數(shù)目一般在2x10^4個左右，而流式質(zhì)譜技術(shù)一次（單樣本）就可分析至少10^5的細(xì)胞，實(shí)現(xiàn)了數(shù)量級的提高，且成本不高于單細(xì)胞RNAseq。

3.應(yīng)用前景大

①流式質(zhì)譜結(jié)果可以給出細(xì)胞亞群的變化，在臨床診斷、疾病機(jī)制研究等方面具有極大的研究前景；

②將金屬標(biāo)簽技術(shù)與其他技術(shù)結(jié)合會有新應(yīng)用方向。除常規(guī)蛋白外，質(zhì)譜流式細(xì)胞技術(shù)還可用于蛋白翻譯后修飾；

③可檢測細(xì)胞存活率、細(xì)胞大小、mRNA轉(zhuǎn)錄子表達(dá)量、DNA合成速率以及蛋白酶活性等。

四、基于高精度質(zhì)譜的免疫多肽組學(xué)分析及新抗原發(fā)現(xiàn)

百泰派克生物科技的基于高精度質(zhì)譜的免疫多肽組學(xué)分析及新抗原發(fā)現(xiàn)一站式解決方案包括我們專有的、高度敏感的免疫肽富集和鑒定方案。我們能夠幫助您實(shí)現(xiàn)10,000個以上I型多肽和10,000個以上II型多肽的鑒定和識別。通過我們優(yōu)化的高通量免疫多肽組學(xué)分析平臺進(jìn)行免疫肽組學(xué)分析，可從zuì小的樣品材料中進(jìn)行可重復(fù)的識別和定量。該服務(wù)可以應(yīng)用于大規(guī)模的研究，旨在助力科研工作者尋找癌癥、免疫疾病及傳染病的解決方案，深入挖掘未知的靶標(biāo)。

五、生物藥物表征

百泰派克基于高分辨率質(zhì)譜技術(shù)，MALDI TOF，高效色譜分離技術(shù)，提供一系列完善的生物藥物分析方案，從dànbáizhì、多肽、抗體、疫苗等生物制品的氨基酸組成和一級結(jié)構(gòu)分析，到產(chǎn)品變異性和純度分析。旨在提供優(yōu)質(zhì)生物藥物分析服務(wù)，幫助生物醫(yī)藥生產(chǎn)商提高生物藥物品質(zhì)。

百泰派克生物科技七大檢測平臺

百泰派克生物科技-生物制品表征，生物質(zhì)譜多組學(xué)優(yōu)質(zhì)服務(wù)商

北京百泰派克生物科技有限公司致力于為生物/制藥和醫(yī)療器械行業(yè)提供質(zhì)量控制檢測和項(xiàng)目驗(yàn)證等zhuānyè服務(wù)。公司實(shí)驗(yàn)室遵循NMPA、ICH、FDA和EMA等的法規(guī)和指導(dǎo)原則，通過CNAS/ISO9001雙重質(zhì)量體系認(rèn)證，建立了完備的質(zhì)量體系，數(shù)據(jù)冷熱/異地備份，設(shè)備定期計(jì)量/期間核查，軟件審計(jì)追蹤，為客戶提供一體化解決方案和技術(shù)服務(wù)，支持新藥研發(fā)、藥物申報(bào)注冊和生產(chǎn)放行。

1.公司采用ISO9001質(zhì)量控制體系，zhuānyè提供以質(zhì)譜為基礎(chǔ)的CRO檢測分析服務(wù)；

2.獲國家CNAS實(shí)驗(yàn)室認(rèn)可，為客戶提供符合全球藥政法規(guī)的藥物質(zhì)量研究服務(wù)；

3.業(yè)務(wù)范圍覆蓋dànbáizhì組學(xué)、多肽組學(xué)、代謝組學(xué)、生物藥物表征、單細(xì)胞分析、單細(xì)胞質(zhì)譜流式、生信云分析以及多組學(xué)生物質(zhì)譜整合分析等；

4.七大質(zhì)量控制檢測平臺，滿足您一站式服務(wù)需求；

5.服務(wù)3000+企業(yè)，10000+客戶的選擇；

6.致力于為您提供優(yōu)質(zhì)的生物質(zhì)譜分析服務(wù)!

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