威立雅Sievers分析儀
確定等效的SIEVERS ECLIPSE*月食細(xì)菌內(nèi)毒素檢測儀的起效光密度值
檢測樣品:制藥用水 藥品
檢測項(xiàng)目:起效光密度值
方案概述:SieversEclipse微孔板的孔的形狀和光路徑長度不同于96孔板的孔的形狀和光路徑長度,因此需要用比爾定律(Beer’sLaw)和吸光度方程來重新計(jì)算SieversEclipse微孔板的光密度值。
目的
本應(yīng)用表明Sievers*Eclipse細(xì)菌內(nèi)毒素檢測儀(BET,Bacterial Endotoxins Testing)所使用的起效光密度(OD,Optical Density)值與96孔微孔板測試所使用的起效光密度值是等效的。Sievers Eclipse微孔板的孔的形狀和光路徑長度不同于96孔板的孔的形狀和光路徑長度,因此需要用比爾定律(Beer’s Law)和吸光度方程來重新計(jì)算Sievers Eclipse微孔板的光密度值。證明上述兩種平臺的光密度值的等效性非常重要,這是因?yàn)樵趧?dòng)態(tài)顯色分析中,起效光密度值用于確定標(biāo)準(zhǔn)品和樣品的起效反應(yīng)時(shí)間。
概述
動(dòng)態(tài)內(nèi)毒素測試依賴于光密度值和內(nèi)毒素濃度變化之間的反比關(guān)系。光密度是“用分光光度計(jì)測量的特定波長的有機(jī)分子懸浮液或溶液所吸收的光量。”1當(dāng)光通過含有標(biāo)準(zhǔn)品(或樣品)和鱟試劑(LAL,Limulus Amoebocyte Lysate,鱟變形細(xì)胞溶解物)的混合液的光學(xué)孔時(shí),軟件就會(huì)報(bào)告光密度值的變化。對于動(dòng)態(tài)分析法來說,起效光密度值是用來確定起效反應(yīng)時(shí)間的恒定值。內(nèi)毒素濃度高的樣品或標(biāo)準(zhǔn)品的反應(yīng)速度較快,溶液顏色會(huì)變黃,使到達(dá)光電二極管的光量較少,因而光密度值較高。起效反應(yīng)時(shí)間(即達(dá)到起效光密度所需的時(shí)間)越短,樣品中的內(nèi)毒素含量就越高。每次測試完畢后,軟件都會(huì)生成標(biāo)準(zhǔn)曲線,顯示起效反應(yīng)時(shí)間(以對數(shù)形式)和標(biāo)準(zhǔn)品的內(nèi)毒素濃度(以對數(shù)形式)之間的線性關(guān)系。然后將反應(yīng)性樣品和陽性產(chǎn)品對照液(PPC,Positive Product Controls)的起效反應(yīng)時(shí)間同標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行對比,得出內(nèi)毒素的量化結(jié)果。測得的起效光密度值經(jīng)過優(yōu)化,都被概括在使用說明(IFU,Instructions For Use)中。起效光密度值可以是一個(gè)定值,也可以是一系列值。起效光密度也被稱為“閾值光密度”或“反應(yīng)光密度”。
Sievers Eclipse的等效光密度
不同的生產(chǎn)商或供應(yīng)商所提供的96孔板的光路徑長度略有不同。平底96孔板的孔通常是截錐形,使微孔板容易從模具上脫模。我們用幾家主要的微孔板生產(chǎn)商、儀器生產(chǎn)商、LAL供應(yīng)商所提供的數(shù)據(jù),根據(jù)96個(gè)孔中共有200µL溶液來確定光路徑長度,得出的數(shù)值范圍是5.707 mm-6.306 mm。為了將上述范圍縮小到一個(gè)定值,位于美國科羅拉多州博爾德市的Sievers分析儀應(yīng)用實(shí)驗(yàn)室重新測量了各種96孔板,得出了光路徑長度范圍的中間值。然后將該值代入以下方程式,就可以將96孔板測試中使用的起效光密度值轉(zhuǎn)換為適用于Eclipse平臺的等效起效光密度值。
用上面的計(jì)算公式以及96孔板和Eclipse微孔板的實(shí)測路徑長度,算出表1中的光密度值,用于Eclipse軟件。
我們并排測試了96孔板和Eclipse微孔板的光密度值,確認(rèn)這兩種平臺的所有的內(nèi)毒素、PPC、%CV(變異系數(shù))值都是等效的。如果鱟試劑生產(chǎn)商提供了光密度值范圍,則重新計(jì)算整個(gè)范圍,然后在Sievers Eclipse平臺上進(jìn)行測試。兩種平臺的所有范圍之間的等效性都得到確認(rèn),從而證明數(shù)值轉(zhuǎn)換是正確的,生成的數(shù)據(jù)是準(zhǔn)確的。如果您的實(shí)驗(yàn)室使用各種起效光密度值,建議您進(jìn)行測試,確定哪個(gè)值適用于各個(gè)樣品,因?yàn)楫?dāng)測試完畢后,就無法在Sievers Eclipse軟件中更改起效光密度值。表1可以幫助您確定適用于您的樣品的等效光密度值。
結(jié)論
雖然Eclipse BET平臺和96孔微孔板的起效光密度值不同,但我們可以用現(xiàn)成的物理方程式來精確計(jì)算出它們的等效值,因此用戶可以放心使用Eclipse平臺測量出來的內(nèi)毒素結(jié)果。如需詳細(xì)的指導(dǎo),請向您所在地的Sievers業(yè)務(wù)代表或應(yīng)用專家查詢。
參考文獻(xiàn)
1.McCullough,Karen Zink.The Bacterial Endotoxins Test:A Practical Approach.DHI Publishing,LLC,2011.
2.Helmenstine,Anne Marie.Beer’s Law Definition and Equation.ThoughtCo,2019.
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