顯微課堂 | Drosophila（果蠅）研究顯微鏡使用指南

提高果蠅工作步驟的效率，促進(jìn)與發(fā)育生物學(xué)、遺傳學(xué)和神經(jīng)科學(xué)有關(guān)的研究。

一個(gè)多世紀(jì)以來(lái)，果蠅（典型的黑腹果蠅）一直被用作模式生物。原因之一是果蠅與人類(lèi)共享許多與疾病相關(guān)的基因。果蠅經(jīng)常被用于發(fā)育生物學(xué)、遺傳學(xué)和神經(jīng)科學(xué)的研究。果蠅的優(yōu)點(diǎn)包括易于飼養(yǎng)且成本低廉、繁殖速度快、基因組測(cè)序以及可獲得各種基因品系。使用徠卡顯微鏡可以進(jìn)行高效的果蠅研究。

使用黑腹蠅蛆的常規(guī)實(shí)驗(yàn)室方法包括：

1. 向胚胎顯微注射DNA進(jìn)行基因改造（轉(zhuǎn)基因）。

2. 通過(guò)觀察解剖特征對(duì)果蠅進(jìn)行基本分類(lèi)的 "揀蠅法"。

3. 熒光篩選，例如觀察胚胎或幼蟲(chóng)，找出成功轉(zhuǎn)染熒光蛋白的胚胎或幼蟲(chóng)。

4. 用于研究大腦或其他解剖結(jié)構(gòu)的解剖案例。

5. 在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中對(duì)篩選出的果蠅（活體和固定的）或解剖結(jié)構(gòu)進(jìn)行成像和記錄。

這些步驟通常使用體視顯微鏡、復(fù)合顯微鏡或共聚焦顯微鏡進(jìn)行。

果蠅的轉(zhuǎn)基因通常是通過(guò)向果蠅胚胎顯微注射DNA來(lái)完成的。進(jìn)行顯微注射需要顯微鏡。

胚胎顯微注射面臨著一些挑戰(zhàn)：

1. 顯微鏡物鏡下有足夠的空間放置微型注射器。

2. 視野小限制了同時(shí)觀察胚胎的數(shù)量。

3. 傷害胚胎的風(fēng)險(xiǎn)。

4. 在進(jìn)行注射時(shí)保持舒適，因?yàn)樽⑸湫枰貜?fù)動(dòng)作，可能需要幾個(gè)小時(shí)。

使用徠卡體視顯微鏡可以克服這些挑戰(zhàn)，該顯微鏡為用戶(hù)提供以下功能：

1. 視野大，可同時(shí)看到多個(gè)胚胎。

2. 配件使顯微鏡更符合人體工程學(xué)，最大限度地減少用戶(hù)的疲勞和勞損。

3. 與市面上的顯微操作設(shè)備兼容。
   
   

   圖 2：示意圖展示了將DNA微量注射到果蠅胚胎中的過(guò)程。

根據(jù)特定的表型或解剖特征對(duì)果蠅進(jìn)行分類(lèi)，即所謂的 "揀蠅"，必須在顯微鏡下進(jìn)行。

與揀蠅相關(guān)的挑戰(zhàn)有：

1. 一些細(xì)節(jié)可能難以觀察到。

2. 小視場(chǎng)限制了同時(shí)觀察到的果蠅數(shù)量。

3. 既要有足夠高的放大倍率來(lái)觀察解剖細(xì)節(jié)，又要有足夠大的景深來(lái)將果蠅按（分類(lèi)）到不同的組中。

4. 用于麻醉果蠅的CO2（二氧化碳）墊對(duì)底座來(lái)說(shuō)太大，存在風(fēng)險(xiǎn)。

然而，使用徠卡體視顯微鏡可以克服這些挑戰(zhàn)。用戶(hù)可以獲得以下好處：

1. FusionOptics技術(shù)可同時(shí)實(shí)現(xiàn)更高的分辨率和更大的景深。

2. 更舒適的設(shè)置，減少疲勞和勞損，采用人體工程學(xué)模塊。

3. 使用中等大小的底座或搖臂支架，為二氧化碳?jí)|留出足夠的空間。

圖 3：使用徠卡體視顯微鏡進(jìn)行果蠅分揀操作。通過(guò)二氧化碳（CO?）管對(duì)果蠅進(jìn)行麻醉（1），并在分揀過(guò)程中使用帶有 CO? 的果蠅操作墊維持麻醉狀態(tài)（2）。樣品由奧地利維也納大學(xué)神經(jīng)生物學(xué)系的T. Hummel 提供。

要找到成功轉(zhuǎn)染熒光蛋白的果蠅胚胎或幼蟲(chóng)，就必須對(duì)其進(jìn)行熒光篩選。這項(xiàng)工作使用熒光體視顯微鏡進(jìn)行。

對(duì)胚胎或幼蟲(chóng)進(jìn)行熒光篩選有一定的難度：

1. 信噪比（SNR）過(guò)低導(dǎo)致分辨率不足，從而難以分辨不同表型的細(xì)微差別。

2. 通常情況下，分辨率和景深之間存在折衷關(guān)系。

3. 果蠅及其食物發(fā)出的自發(fā)熒光。

4. 長(zhǎng)時(shí)間使用顯微鏡時(shí)保持舒適。

使用徠卡體視顯微鏡可以克服這些篩選難題。它可以幫助用戶(hù)完成以下工作：

1. 利用TripleBeam技術(shù)降低熒光背景噪聲，提高信噪比。

2. 得益于FusionOptics技術(shù)，可同時(shí)獲得高分辨率和大景深效果。

3. 利用計(jì)算清除功能，即使是胚胎或幼蟲(chóng)深處的細(xì)節(jié)也能清晰地顯示出來(lái)。

4. 多種對(duì)比方法和專(zhuān)門(mén)設(shè)計(jì)的反射鏡，配備Leica透射光底座，可減少自發(fā)熒光。

5. 使用人體工程學(xué)模塊，用戶(hù)可以舒適地工作，減少疲勞和勞累。

編輯搜

圖 4：使用THUNDER顯微鏡拍攝并經(jīng)過(guò)LVCC（大體積計(jì)算清除）處理的黑腹果蠅卵泡。綠色區(qū)域?yàn)閍PKC染色，洋紅色區(qū)域?yàn)镈lg染色。樣品由美國(guó)加利福尼亞大學(xué)伯克利分校的M. Khoury和D. Bilder提供。

解剖果蠅是在必須研究大腦或其他解剖結(jié)構(gòu)時(shí)進(jìn)行的。這也需要顯微鏡。

果蠅解剖面臨的挑戰(zhàn)有：

1. 標(biāo)本小而易碎，因此很難看到內(nèi)部結(jié)構(gòu)。

2. 在大腦解剖過(guò)程中，應(yīng)避免與空氣接觸。

3. 實(shí)現(xiàn)速度和精度都很困難。

4. 在溶液中解剖果蠅時(shí)的反光。

使用徠卡體視顯微鏡可以克服解剖難題。用戶(hù)可以利用以下優(yōu)勢(shì)：

1. 利用體視顯微鏡輕松確定蠅類(lèi)標(biāo)本的三維方向。

2. 采用人體工程學(xué)模塊，工作舒適，減少疲勞和勞累。

3. 使用偏振鏡和各種照明選項(xiàng)可以大大減少溶液表面的反射。

編輯搜圖

圖 5：使用M125體視顯微鏡解剖的三只果蠅大腦圖像。果蠅大腦表達(dá)紅色熒光蛋白（RFP）。圖像由徠卡熒光體視顯微鏡拍攝。大腦的取向如圖所示，以便后續(xù)共聚焦成像。樣品由奧地利維也納大學(xué)神經(jīng)生物學(xué)系的L. Geid和T. Hummel提供。

在對(duì)果蠅進(jìn)行篩選和可能的解剖之后，往往需要對(duì)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行成像和記錄。這一步需要一臺(tái)帶有攝像頭和軟件的顯微鏡。

果蠅實(shí)驗(yàn)成像和記錄方面的主要挑戰(zhàn)是：

1. 避免蠅類(lèi)標(biāo)本因光和熱的照射而受損，尤其是在實(shí)時(shí)成像過(guò)程中。

2. 標(biāo)本移出視野。

3. 由于光散射的原因，在對(duì)厚結(jié)構(gòu)或標(biāo)本深處的結(jié)構(gòu)成像時(shí)，會(huì)出現(xiàn)焦外模糊的情況。

4. 獲取3D標(biāo)本的對(duì)焦2D圖像。

徠卡顯微鏡可以克服這些挑戰(zhàn)。以下是其優(yōu)勢(shì)：

1. 使用高幀頻、高靈敏度的顯微鏡相機(jī)記錄快速事件。

2. 借助計(jì)算清除功能，快速查看果蠅標(biāo)本深處的細(xì)節(jié)。

3. 使用寬場(chǎng)顯微鏡對(duì)果蠅標(biāo)本進(jìn)行更柔和的光照射。

4. 利用擴(kuò)展景深 (EDOF) 成像技術(shù)獲取整個(gè)Z疊的同焦圖像。

5. 利用光片和共聚焦顯微鏡獲得更高分辨率的果蠅標(biāo)本圖像。

編輯

圖 6：果蠅胚胎神經(jīng)元中鈣瞬變的時(shí)間序列成像，每幅圖像（A–F）代表約10.5秒的平均時(shí)間間隔。圖像使用THUNDER成像儀和計(jì)算清除技術(shù)獲取。樣品由美國(guó)加利福尼亞州Clandinin實(shí)驗(yàn)室的A. Carreira-Rosario提供

相關(guān)產(chǎn)品：

THUNDER Imager Tissue全景組織顯微成像系統(tǒng)

M125 C & M205 C 編碼型體視顯微鏡

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