ELISA試劑盒酶聯(lián)免疫法基本原理及注意事項

ELISA試劑盒酶聯(lián)免疫法留神事項：
⒈ 正式試驗時，應(yīng)別離以陽性對照與陰性對照操控試驗條件，待檢樣品應(yīng)作一式二份，以保證試驗效果的性。有時本底較高，說明有非特異性反響，可選用羊血清、兔血清或BSA等封閉。
⒉ 在ELISA中，進行各項試驗條件的挑選是很首要的，其間包含：
⑴ 固相載體的挑選：很多物質(zhì)可作為固相載體，如聚氯乙烯、聚苯乙烯、聚丙酰胺和纖維素等。其辦法可所以凹孔平板、試管、珠粒等。當(dāng)時常用的是40孔聚苯乙烯凹孔板。不論何種載體，在運用前均可進行挑選：用等量抗原包被，在同一試驗條件下進行反響，查詢其顯色反響是不是均一性，據(jù)此判明其吸附功能是不是超卓。
⑵ 包被抗體（或抗原）的挑選：將抗體（或抗原）吸附在固相載體外表時，央求純度要好，吸附時一般央求PH在9.0～9.6之間。吸附溫度，時刻及其蛋白量也有必定影響，一般多選用4℃18～24小時。蛋白質(zhì)包被的zui適濃度需進行滴定：即用不一樣的蛋白質(zhì)濃度（0.1、1.0和10μg/ml等）進行包被后，在其它試驗條件相一同，查詢陽性標(biāo)本的OD值。挑選OD值zui大而蛋白量zui少的濃度。對于大都蛋白質(zhì)來說一般為1～10μg/ml。
⑶ ELISA試劑盒酶符號抗體作業(yè)濃度的挑選：首先用直接ELISA法進行初步效價的滴定（見酶符號抗體部份）。然后再固定其它條件或選用“方陣法"（包被物、待檢樣品的參看品及酶符號抗體別離為不一樣的稀釋度）在正式試驗系統(tǒng)里地滴定其作業(yè)濃度。
⑷ 酶的底物及供氫體的挑選：對供氫體的挑選央求是價廉、安全、有明顯地顯色反響，而本身無色。有些供氫體（如OPD等）有潛在的致癌效果，應(yīng)留神防護。有條件者應(yīng)運用不致癌、靈敏度高的供氫體，如TMB和ABTS是當(dāng)時較為滿意的供氫體。底物效果一段時刻后，應(yīng)參加強酸或強堿以間斷反響。一般底物效果時刻，以10-30分鐘為宜。底物運用液有必要新鮮制造，尤其是H2O2在臨用前參加。①使抗原或抗體結(jié)合到某種固相載體外表，并堅持其免疫活性。
②使抗原或抗體與某種酶連接成酶標(biāo)抗原或抗體，這種酶標(biāo)抗原或抗體既保留其免疫活性，又保留酶的活性。在測守時，把受檢標(biāo)本（測定其間的抗體或抗原）和酶標(biāo)抗原或抗體按不一樣的進程與固相載體外表的抗原或抗體起反響。用洗刷的辦法使固相載體上構(gòu)成的抗原抗體復(fù)合物與其他物質(zhì)分隔，終究結(jié)合在固相載體上的酶量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量成必定的份額。參加酶反響的底物后，底物被酶催化變?yōu)橛猩唐?，商品的量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量直接有關(guān)，故可根據(jù)色彩反響的深淺來進行定性或定量分析。因為酶的催化頻率很高，故可很大地拓展反響效果，從而使測定辦法抵達很高的敏感度。
ELISA試劑盒可用于測定抗原，也可用于測定抗體。在這種測定辦法中有3種必要的試劑：
①固相的抗原或抗體
②酶符號的抗原或抗體
③酶效果的底物。根據(jù)試劑的來歷和標(biāo)本的性狀以及檢查的具備條件，可規(guī)劃出各種不一樣類型的檢查辦法。