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細胞固定及常用的固定液
點擊次數：7062 發(fā)布時間：2017-4-1
固定及常用的固定液
• 取材后的組織需立刻投于固定劑中
– 固定使組織和細胞的蛋白質凝固，終止內源性或外源性酶反應，防止組織自溶或異溶，以保持原有結構和形態(tài)；
– 對免疫組化而言更有原位保存抗原的作用，避免抗原失活或彌散。
• 常用固定液：固定劑品種很多，但大多屬于醛類和醇類。其固定原理不同，各有優(yōu)缺點。
– 醛類（常用甲醛、戊二醛和多聚甲醛）
– 醇類（常用乙醇）
– 其它 （丙酮）
(1) 醛類
• 甲醛(福爾馬林)應用zui廣
– 原理：形成分子間的交聯，影響蛋白構型而使之固定。
– 優(yōu)點：形態(tài)結構保存好，且穿透性強，組織收縮少。
– 缺點：
• 甲醛放置過久可氧化為甲酸，使溶液pH降低，影響染色；
• 醛基與抗原蛋白的氨基交聯形成羧甲基，使抗原決定簇的三維構象出現空間障礙；
• 分子間交聯形成的網格結構可能部分或*掩蓋某些抗原決定簇，使之不能充分暴露。可造成假陰性的染色結果。
– 注意事項：
• 縮短固定時間，降低固定溫度(4?C)，為此組織塊不宜過厚。
• 改用中性緩沖福爾馬林，以pH值7.2～7.4 0.01mol/L的磷酸鹽緩沖液配制成10％甲醛固定液，減少固定液pH的變化。
• 固定后充分水洗以減少分子間交聯。
• 切片在作免疫組化染色前，先經預處理使抗原再現(抗原修復)。
• 戊二醛：
– 穿透性強，微細結構保存好，但對抗原有一定影響，常與其他固定劑聯合用作免疫電鏡固定液。
• 多聚甲醛(常用4%)：
– 可用于免疫電鏡；也可用于免疫熒光染色。
• 主要檢測組織內一些性能嬌弱的抗原特別是細胞表面抗原，例如各類淋巴細胸分化決定簇(CD)、主要組織相容性抗原等。
(2) 醇類
• zui常用的醇類固定劑是乙醇。
– 其固定作用：使細胞內蛋白、糖類發(fā)生沉淀。
– 優(yōu)點：穿透性強、抗原性保存好。
– 缺點：
• 脫水性強，易引起組織收縮、變硬，影響切片質量，因而乙醇固定時間不宜過長(2h內)。
• 乙醇使蛋白變性的作用輕，固定后可再溶解；染色過程中，溫育時間長，抗原可流失而減弱反應強度。
(3) 其它固定劑
• 丙酮：
– 對抗原性的保存好，但脫水性更強，較少 用于組織標本，但細胞爬片常用丙酮固定。
抗原修復——原因
• 常規(guī)的石蠟切片標本均用甲醛固定，結果使得：
– 抗原性物質形成醛鍵、羧甲鍵而被封閉了部分抗原決定簇；
– 蛋白之間發(fā)生交聯而使抗原決定簇隱蔽。
• 要求：在染色時，需要先進行抗原修復或暴露，即將固定時分子之間所形成的交聯破壞，而恢復抗原的原有空間形態(tài)