酵母感受態(tài)細胞的制備和保存

酵母，如釀酒酵母、裂殖酵母和畢赤酵母，通常用于生物學實驗研究。酵母是易于培養(yǎng)的單細胞真核生物，他們的基因和蛋白質(zhì)與哺乳動物具有很好的相似性，所以是的生物模型。

酵母細胞用于研究基因功能，蛋白質(zhì)相互作用，細胞通路等，也是大規(guī)模異源蛋白表達和小分子生產(chǎn)的宿主，在發(fā)酵，釀造和制藥行業(yè)等起著*的作用。涉及酵母的常見的實驗有酵母雙/三雜交系統(tǒng)，突變體篩選庫和同源重組，等等。

一、為什么我們需要酵母感受態(tài)細胞?

通常，在實驗過程中需外源DNA引入到酵母細胞。引入基因片段（線性ssDNA或質(zhì)粒）是通過酵母細胞的轉(zhuǎn)化來實現(xiàn)的，具體方法有化學法，如醋酸鋰和聚乙二醇(PEG)或電穿孔法。有效的酵母轉(zhuǎn)化需要高質(zhì)量的酵母感受態(tài)細胞為開始。勝任力則是指細胞能吸收游離的細胞外的遺傳物質(zhì)(如質(zhì)粒DNA)的能力。

二、酵母感受態(tài)細胞的制備

獲得感受態(tài)細胞相當簡單，但許多研究人員在實現(xiàn)良好的生存比例和轉(zhuǎn)換效率時  遇到問題。常見的誤區(qū)包括由于制備條件惡劣導致高的細胞死亡率，或由于無效的感受態(tài)細胞制備導致轉(zhuǎn)化效率低。

雖然酵母細胞和大腸桿菌一樣容易生長和轉(zhuǎn)化，但它們需要不同的處理方法來制備感受態(tài)細胞和轉(zhuǎn)化。酵母細胞像哺乳動物細胞一樣，有類似的處理程序。典型的酵母感受態(tài)細胞制備協(xié)議如下:

1. 過夜培養(yǎng)你想轉(zhuǎn)化的酵母菌菌株，使用營養(yǎng)豐富的培養(yǎng)基培養(yǎng)不含質(zhì)粒的細胞。對于已經(jīng)含有質(zhì)粒的細胞，使用適當?shù)倪x擇性培養(yǎng)基來維持質(zhì)粒。

2. 當細胞密度達到1 - 2 x 107cells/mL，離心收獲細胞。細胞密度可以通過使用分光光度計在OD600檢測，或者使用血球計在顯微鏡下計數(shù)細胞。

3. 沖洗細胞，重懸于無菌水，離心，棄上清，重復此步驟兩次以*清洗細胞。

4. zui后一次洗完，將細胞重懸于感受態(tài)細胞溶液，分裝，大約每管108個細胞，每個轉(zhuǎn)化反應將使用這些數(shù)量的細胞。分裝好的管子放于-80°C，供以后實驗使用。

5. 在所有步驟中,使用質(zhì)量好的無菌過濾器消毒過的試劑,以防止污染問題。

感受態(tài)細胞溶液包含*濃度的冷凍保護劑，這些濃度應該在你的實驗室標準化，根據(jù)使用的酵母菌株和細胞的濃度。標準協(xié)議使用5%的甘油 + 10% DMSO溶液混合,這種配方被廣泛應用來制備感受它細胞，也可根據(jù)具體情況進行輕微的改變或調(diào)整。

關于冷凍保護劑

甘油和二甲亞砜(DMSO)是zui常見的細胞可透過性冷凍保護劑，用于準備感受態(tài)細胞。它們穿透細胞，防止冰晶的形成，冰晶可能會在凍結過程中導致膜破裂。甘油和DMSO也有一定的缺點，他們可能會導致細胞毒性,特別是在解凍過程中。非細胞透過性的試劑如蔗糖和海藻糖等也可用于替代物。山梨糖醇鈣也是一個好的冷凍保護劑，尤其適用于電穿孔制備感受態(tài)細胞。

三、酵母感受態(tài)細胞的儲存

每次轉(zhuǎn)化時使用新鮮的感受態(tài)細胞是明智的，因為長時間儲存，轉(zhuǎn)化效率會降低，但這并不總是可行的。

感受態(tài)細胞可以存儲在-80°C長達一年，沒有轉(zhuǎn)化潛能的損失。然而, 瞬間凍結在液氮或-80°C冰箱是不建議的。感受態(tài)細胞需要在冷凍保護劑中，像哺乳動物細胞一樣緩慢地冷凍。

1. 使用硬紙板或聚苯乙烯泡沫塑料盒等儲存。

2. 用紙片等將盒子里的細胞管隔開，分成多個小格子。

3. 復蘇過程中，在37°C解凍細胞，轉(zhuǎn)化前用豐富培養(yǎng)基清洗防凍劑。