考馬斯亮蘭的測(cè)定含量

簡(jiǎn)介

該方法用于大多數(shù)蛋白質(zhì)的定量是比較精確的，但不適用于小分子堿性多肽的定量。如核糖核酸酶或溶菌酶。去污劑的濃度超過(guò)0.2%影響測(cè)定結(jié)果，如TritonX-100、SDS、NP-40等。常用于細(xì)胞骨架的檢驗(yàn)。

濃染液

將100mg考馬斯亮藍(lán)G-250溶于50mL 95%乙醇，加入100mL 85%的磷酸，然后，用蒸餾水補(bǔ)充至1000mL，此染液放4℃至少6個(gè)月保持穩(wěn)定。

樣本準(zhǔn)備

盡量使用與待測(cè)樣本性質(zhì)相近的蛋白質(zhì)作為標(biāo)準(zhǔn)品，例如測(cè)定抗體，可用純化的抗體作為標(biāo)準(zhǔn)。如果待測(cè)樣本是未知的，也可用抗體作為標(biāo)準(zhǔn)蛋白。通常在20μg—150μg/100μL之間繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

溶解

將待測(cè)樣本溶于100~1緩沖溶液中，該緩沖溶液應(yīng)與制作標(biāo)準(zhǔn)曲線的緩沖溶液相同(最好用PBS)。

稀釋

按1：5用蒸餾水稀釋濃染料結(jié)合溶液，如出現(xiàn)沉淀，過(guò)濾除去。

作用

每個(gè)樣本加5mL稀釋的染料結(jié)合溶液，作用5～30min。染液與蛋白質(zhì)結(jié)合后，將由紅色變?yōu)樗{(lán)色，在595nm波長(zhǎng)下測(cè)定其吸光度。注意，顯色反應(yīng)不得超過(guò)30min。

計(jì)算

根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算待測(cè)樣本的濃度。