流式細(xì)胞術(shù) FCM 介紹及簡易操作步驟--新手適用

流式細(xì)胞術(shù) FCM 介紹及簡易操作步驟--新手適用

一. 流式細(xì)胞術(shù)概述

     流式細(xì)胞術(shù)（Flow Cytometry， FCM）是七十年代發(fā)展起來的高科學(xué)技術(shù)，它集計(jì)算機(jī)技術(shù)、激光技術(shù)、流體力學(xué)、細(xì)胞化學(xué)、細(xì)胞免疫學(xué)于一體， 同時(shí)具有分析和分選細(xì)胞功能。它不僅可測量細(xì)胞大小、內(nèi)部顆粒的性狀，還可檢測細(xì)胞表面和細(xì)胞漿抗原、細(xì)胞內(nèi)DNA、RNA含量等，可對(duì)群體細(xì)胞在單細(xì)胞水平上進(jìn)行分析， 在短時(shí)間內(nèi)檢測分析大量細(xì)胞，并收集、儲(chǔ)存和處理數(shù)據(jù)，進(jìn)行多參數(shù)定量分析; 能夠分類收集（分選）某一亞群細(xì)胞，分選純度＞95%。在血液學(xué)、免疫學(xué)、腫瘤學(xué)、藥物學(xué)、分子生物學(xué)等學(xué)科廣泛應(yīng)用。
國內(nèi)使用的流式細(xì)胞儀主要由美國的兩個(gè)廠家生產(chǎn): Becton-Dickinson公司（簡稱B-D公司）和BECKMAN- COULTER公司。流式細(xì)胞儀主要有兩型:臨床型（又稱小型機(jī)、臺(tái)式機(jī)）和綜合型（又稱大型機(jī)、分析型）。B-D公司產(chǎn)品為FACS Vantage和FACS Calibur。BECKMAN-COULTER公司產(chǎn)品為EPICS ALTRA和EPICS XL/XL-MCL。EPICS XL/XL-MCL和FACS Calibur是臨床型;EPICS ALTRA和 FACS Vantage是綜合型，除具備檢測分析功能外，還具有細(xì)胞分選功能，多用于科學(xué)研究。

二.流式細(xì)胞儀主要技術(shù)指標(biāo)

1．流式細(xì)胞儀的分析速度：
一般流式細(xì)胞儀每秒檢測1000～ 5000個(gè)細(xì)胞，大型機(jī)可達(dá)每秒上萬個(gè)細(xì)胞。
2．流式細(xì)胞儀的熒光檢測靈敏度：一般能測出單個(gè)細(xì)胞上<600個(gè)熒光分子，兩個(gè)細(xì)胞間的熒光差＞5%即可區(qū)分。
3．前向角散射（FSC）光檢測靈敏度：前向角散射（FSC）反映被測細(xì)胞的大小，一般流式細(xì)胞儀能夠測量到0.2μm～０.5μm。
4．流式細(xì)胞儀的分辨率：通常用變異系數(shù)CV值來表示，，一般流式細(xì)胞儀能夠達(dá)到<2.0%，這也是測量標(biāo)本前用熒光微球調(diào)整儀器時(shí)要求必須達(dá)到的。
   5．流式細(xì)胞儀的分選速度：一般流式細(xì)胞儀分選速度＞1000個(gè)/秒，分選細(xì)胞純度可達(dá)99%以上。

        三.流式細(xì)胞儀主要構(gòu)造和工作原理    流動(dòng)室及液流驅(qū)動(dòng)系統(tǒng)

流式細(xì)胞儀主要由以下五部分構(gòu)成:①流動(dòng)室及液流驅(qū)動(dòng)系統(tǒng)②激光光源及光束形成系統(tǒng)③光學(xué)系統(tǒng)④信號(hào)檢測與存儲(chǔ)、顯示、分析系統(tǒng)⑤細(xì)胞分選系統(tǒng)。
流動(dòng)室（Flow Cell或Flow Chamber）是流式細(xì)胞儀的核心部件，流動(dòng)室由石英玻璃制成，單細(xì)胞懸液在細(xì)胞流動(dòng)室里被鞘流液包繞通過流動(dòng)室內(nèi)的一定孔徑的孔，檢測區(qū)在該孔的中心，細(xì)胞在此與激光垂直相交，在鞘流液約束下細(xì)胞成單行排列依次通過激光檢測區(qū)。流動(dòng)室里的鞘液流是一種穩(wěn)定流動(dòng)，控制鞘液流的裝置是在流體力學(xué)理論的指導(dǎo)下由一系列壓力系統(tǒng)、壓力感受器組成，只要調(diào)整好鞘液壓力和標(biāo)本管壓力， 鞘液流包繞樣品流并使樣品流保持在液流的軸線方向，能夠保證每個(gè)細(xì)胞通過激光照射區(qū)的時(shí)間相等，從而使激光激發(fā)的熒光信息準(zhǔn)確無誤。見圖12.1流動(dòng)室示意圖。流動(dòng)室孔徑有60μm、100μm、150μm 、250μm等多種，供研究者選擇。小型儀器一般固定裝置了一定孔徑的流動(dòng)室。

圖12.1流動(dòng)室示意圖（采自Coulter Training Guide）

      四. 流式細(xì)胞儀主要構(gòu)造和工作原理    激光光源及光束形成系統(tǒng)

    流式細(xì)胞儀可配備一根或多根激光管，常用的激光管是氬離子氣體激光管，它的發(fā)射光波長488ηm，此外可配備氦氖離子氣體激光管（波長633ηm）和/或紫外激光管。

流式細(xì)胞儀的主要測定信號(hào)熒光是由激發(fā)光激發(fā)的，熒光信號(hào)的強(qiáng)弱與激發(fā)光的強(qiáng)度和照射時(shí)間相關(guān)，激光是一種相干光源，它能提供單波長、高強(qiáng)度、高穩(wěn)定性的光照，正是能達(dá)到這一要求的理想的激發(fā)光光源。
    在激光光源和流動(dòng)室之間有兩個(gè)圓柱形透鏡，將激光光源發(fā)出的橫截面為圓形的激光光束聚焦成橫截面較小的橢圓形激光光束（22μm×66μm），在這種橢圓形激光光斑內(nèi)激光能量成正態(tài)分布，使通過激光檢測區(qū)的細(xì)胞受照強(qiáng)度一致。

五. 流式細(xì)胞儀主要構(gòu)造和工作原理    光學(xué)系統(tǒng)

流式細(xì)胞儀的光學(xué)系統(tǒng)由若干組透鏡、小孔、濾光片組成，大致可分

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