ELISA測定的常用模式五--競爭法測抗體

ELISA測定的常用模式五--競爭法測抗體
 

    抗體的測定一般不使用競爭法。當(dāng)抗原中雜質(zhì)難以去除或抗原的結(jié)合特異性不穩(wěn)定時(shí)，可采用這種模式測定抗體。如乙型肝炎病毒核心抗體（HBcAb）和乙型肝炎病毒e抗體（HBe·Ab）的測定，由于e抗原較核心抗原僅多29個(gè)氨基酸，e抗原很容易轉(zhuǎn)變?yōu)楹诵目乖?，因此?span lang="EN-US">HBcAb和HBeAb的測定均采用競爭法。但其測定具體模式有區(qū)別。抗原的固相化既可以直接進(jìn)行，亦可以通過相應(yīng)特異抗體而間接固相化。下面就HBcAb和HBeAb ELISA測定具體操作步驟分述如下。

    1．HBcAb的競爭法測定

    （1）先將HBcAg在碳酸鹽緩沖液中4~C過夜包被，形成固相抗原，洗滌去除未與固相結(jié)合或結(jié)合不緊的抗體后，用小牛血清或牛血清白蛋白等封閉，洗滌去除未結(jié)合的部分及雜質(zhì)。

    （2）同時(shí)加入待測樣本和酶標(biāo)的特異抗體，溫育一定時(shí)間后洗板；此步中，待測樣本的抗體將與酶標(biāo)抗體競爭與固相上特異抗原結(jié)合。

    （3）加入酶底物，溫育顯色測定，顯色的強(qiáng)弱與待測樣本中的相應(yīng)抗體的含量成反比（圖2-8）

2.HBeAb的競爭法測定

    （1）先將HBeAb在碳酸鹽緩沖液中4℃過夜包被，形成固相抗體，洗滌去除未與固相結(jié)合或結(jié)合不緊的抗原后，用小牛血清或牛血清白蛋白等封閉，洗滌去除未結(jié)合的部分及雜質(zhì)；

    （2）同時(shí)加入待測樣本和中和抗原HBeAg，溫育一定時(shí)間后洗板；此步中，待測樣本的抗體將與固相抗體競爭結(jié)合與中和抗原HBeAg，待測樣本中HBeAb濃度越高，則與固相HBe—Ab結(jié)合的HBeAg越少，反之亦然；

    （3）加入酶標(biāo)的特異抗體，溫育一定時(shí)間后洗板；此步中，酶標(biāo)抗體將與結(jié)合于固相抗體上的特異抗原結(jié)合；

    （4）加入酶底物，溫育顯色測定，顯色的強(qiáng)弱與待測樣本中的相應(yīng)抗體的含量成反比（圖2-9）

    HBeAb之所以要采用此種模式測定，主要是HBeAg的不穩(wěn)定所致，如在固相直接包被HBeAg，則會(huì)因?yàn)?span lang="EN-US">HBeAg向HBcAg的易轉(zhuǎn)變性，而導(dǎo)致測定誤差。

    抗體的競爭法測定不同于只有單個(gè)抗原決定簇的小分子抗原的競爭法測定，其測定的可靠性，在很大程度上受競爭抗體的特異性和親和力大小的影響，競爭抗體與待測抗體在結(jié)合的特異性及親和力越接近一致，則測定的可靠性越強(qiáng)，但競爭用抗體均為相應(yīng)抗原免疫動(dòng)物所得，與機(jī)體感染病毒后所產(chǎn)生的抗體肯定會(huì)有所差異，因而，在目前HBeAb和HBcAb的臨床檢測中，常有難以解釋的測定結(jié)果出現(xiàn)，這與其在方法學(xué)上的固有缺陷是分不開的。

更多ELISA試劑盒，請(qǐng)登入

http://www.biohj.com/product.aspx?cid=112   http://www.biohj.com
查詢或sale@biohj.com     :   ：  

廈門慧嘉生物科技有限公司    歡迎與我們！