酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定ELISA之顯色與比色

酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定ELISA之顯色與比色

    在目前的以HRP作為標(biāo)記酶的商品ELISA試劑盒中，如以TMB為底物，則提供的底物為A和B兩瓶應(yīng)用液；如以OPD為底物，則試劑盒提供OPD片劑或粉劑，臨用前配制。一般商品試劑盒顯色反應(yīng)條件為37℃或室溫反應(yīng)15～30min。從理論上說(shuō)，37℃30min才可以使HRP的底物催化反應(yīng)*，盡管在zui初的10min內(nèi)，絕大部分催化反應(yīng)即可完成。因此，為使弱陽(yáng)性樣本孔能有充分的顯色，建議在37℃下反應(yīng)25～30min后，終止反應(yīng)比色測(cè)定。

    此外，在加入底物開(kāi)始顯色反應(yīng)前，是先檢查一下底物溶液的有效性，即可將A和B兩種液各加1滴于清潔的空板孔或eppendorf管中，觀察是否有顯色出現(xiàn)，如有，則說(shuō)明底物已變質(zhì)。以OPD為底物，配好后應(yīng)為五色，否則就不能使用。以TMB為底物，整個(gè)顯色反應(yīng)過(guò)程無(wú)需避光，而以OPD為底物，則需避光進(jìn)行。關(guān)于TMB和OPD的顯色反應(yīng)特點(diǎn)及注意點(diǎn)可參考前面有關(guān)章節(jié)內(nèi)容。顯色反應(yīng)完成后，加入酸終止反應(yīng)，振蕩混勻后即可進(jìn)行下面的比色測(cè)定或肉眼判斷結(jié)果。

    ELISA的比色測(cè)定由酶標(biāo)儀進(jìn)行。有的同行可能會(huì)認(rèn)為，既然由酶標(biāo)儀進(jìn)行，那么此時(shí)便可以萬(wàn)事大吉了，其實(shí)不然，因?yàn)楫?dāng)代較為*的酶標(biāo)儀，均有較多的功能，使用不當(dāng)，會(huì)得到令人難以理解的結(jié)果。如使用酶標(biāo)儀比色測(cè)定后，有許多的陰性測(cè)定孑L的吸光度值為負(fù)數(shù)；或測(cè)定假陽(yáng)性率大大增加等等。這主要是沒(méi)有正確地理解和使用酶標(biāo)儀所致。

    1．比色測(cè)定時(shí)，一定要注意酶標(biāo)儀的波長(zhǎng)是否已調(diào)至合適或所用濾光片是否正確。由于有的臨床實(shí)驗(yàn)室在進(jìn)行ELISA測(cè)定時(shí)，以TMB為底物和以OPD為底物的試劑盒均有使用，而前者比色波長(zhǎng)為450nm，后者為492nm，濾光片需根據(jù)要求隨時(shí)更換。因此，容易出現(xiàn)濾光片錯(cuò)用的問(wèn)題。

    2．單波長(zhǎng)或雙波長(zhǎng)比色選擇的問(wèn)題。中檔以上的酶標(biāo)儀基本上都同時(shí)具有單波長(zhǎng)和雙波長(zhǎng)比色功能。所謂的單波長(zhǎng)比色即是通常的以對(duì)顯色具有zui大吸收的波長(zhǎng)如450nm或492nm進(jìn)行比色測(cè)定；而雙波長(zhǎng)比色則是酶標(biāo)儀在敏感波長(zhǎng)如450nm和非敏感波長(zhǎng)如630nm下各測(cè)定1次，敏感波長(zhǎng)下的吸光度測(cè)定值為樣本測(cè)定酶反應(yīng)特異顯色的吸光度與板孔上指紋、刮痕、灰塵等臟物所致的吸光度之和；非敏感波長(zhǎng)下測(cè)定即改變波長(zhǎng)至一定值，使得樣本測(cè)定酶反應(yīng)特異顯色的吸光度值為零，此時(shí)測(cè)得的吸光度即為臟物的吸光度值。

    zui后酶標(biāo)儀給出的數(shù)值為敏感波長(zhǎng)下的吸光度值與非敏感波長(zhǎng)下的吸光度值的差。因此，雙波長(zhǎng)比色測(cè)定具有能排除由微滴板本身、板孔內(nèi)標(biāo)本的非特異吸收、指紋、刮痕、灰塵等對(duì)特異顯色測(cè)定吸光度的影響的優(yōu)點(diǎn)，一般不必設(shè)空白孔。如在使用雙波長(zhǎng)比色時(shí)，仍設(shè)空白孔，就可能會(huì)造成前面提到的測(cè)定孔吸光度為負(fù)數(shù)的現(xiàn)象。由于ELISA測(cè)定中單個(gè)空白孔的非特異吸收具有一定程度的不確定性，也就是說(shuō)每次測(cè)定或同次測(cè)定空白孔位置的不同均有可能得到不同吸光度測(cè)定值，故而在ELISA測(cè)定比色時(shí)，是使用雙波長(zhǎng)比色。

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