以生物素—親合素反應(yīng)為基礎(chǔ)的放大系統(tǒng)

以生物素—親合素反應(yīng)為基礎(chǔ)的放大系統(tǒng)

    生物素是維生素B復(fù)合物的水溶性成分之一，分子量244，可自卵黃提取或人工合成。生物素作為各種羧化酶的輔酶（又稱為輔酶R或維生素H）參與各種羧化反應(yīng)。

    親合素是從卵清中提取的一種67kD糖蛋白，生物素又叫維生素H，幾乎存在于所有細(xì)胞中，盡管含量較少。天然親合素是由4個(gè)亞單位組成的堿性糖蛋白，分子量為66 000～68000D，等電點(diǎn)（p1）為10．5。親合素活性單位的定義為：凡結(jié)合1ug生物素所需的親合素的量為親合素的一個(gè)活性單位。每毫克親合素zui多能結(jié)合14／tg生物素，也就是說(shuō)每毫克親合素所能獲得的zui高的特異活性為14 U。鏈霉菌親生物素蛋白（streptavidin）的特性非常類似于親合素，可取代親合素用于涉及到生物素—親合素系統(tǒng)的酶聯(lián)免疫測(cè)定技術(shù)，而且非特異顯色較使用生物素更低。

    生物素—親合素系統(tǒng)之所以能成為免疫測(cè)定技術(shù)中的重要工具，主要是因?yàn)槠溆邢率鰩讉€(gè)特點(diǎn)：①親合素對(duì)生物素的親和力*，親和常數(shù)101‘／mol，為抗原抗體反應(yīng)的百萬(wàn)倍，具高度特異性和穩(wěn)定性。②生物素分子小，結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，極易與抗體、核酸、多糖及多種酶等生物大分子以共價(jià)鍵穩(wěn)定結(jié)合，同時(shí)對(duì)結(jié)合物的原始生物活性無(wú)不良影響。③親合素性質(zhì)極為穩(wěn)定，每分子可結(jié)合4個(gè)生物素衍生物，其作為生物素化的分子之間的橋接物，起放大作用。同時(shí)，它又是糖蛋白，可直接與各種生物分子如IgG及茶堿、苯妥英、蛋白質(zhì)等耦聯(lián)。

    由生物素—親合素反應(yīng)建立放大系統(tǒng)，一般有兩種方法，其一是用生物奉標(biāo)記抗體，與固相抗原結(jié)合后，再加入親合素—酶結(jié)合物，從而使測(cè)定反應(yīng)放大；其二是使用生物素—抗體、游離親合素和生物素—酶結(jié)合物三種試劑，試劑加入順序?yàn)樯锼?/span>—抗體、親合素和生物素—酶。該方法之所以可行，在于親合素對(duì)生物素的四價(jià)結(jié)合能力，上述多步模式也可通過(guò)預(yù)先制成可溶的親合素—生物素化酶復(fù)合物而得到簡(jiǎn)化，亦即所謂的ABC（avidin—biotin—complex）方法。但上述方法有時(shí)會(huì)見(jiàn)到較高的非特異背景顯色，這通常是由于帶陽(yáng)電荷的親合素分子（等電點(diǎn)為10）的非特異相互作用的結(jié)果，因此，目前常用與親合素具同樣結(jié)合特性的從鏈霉親生物素蛋白（streptomyces avidinii）中提取的中性蛋白——鏈霉親合素（streptavidin）來(lái)代替親合素。普通的生物素—親合素放大系統(tǒng)可使常規(guī)的EIA方法的測(cè)定敏感性提高2—100倍。

    Wilson等報(bào)道了一種生物素—鏈霉親合素的新型EIA測(cè)定放大系統(tǒng)，稱之為酶復(fù)合物放大（enzyme complex amplification，ECA）系統(tǒng)，其較常規(guī)的生物素—鏈霉親合素系統(tǒng)的放大作用要高1～2個(gè)梯度，與RIA相似。ECA放大系統(tǒng)的關(guān)鍵是ECA試劑，該試劑是鏈霉親合素、生物素—HRP和抗HRP-生物素的聚合體，可用來(lái)直接測(cè)定生物素化的抗原，或用于使用生物素化的抗體的ELISA中，亦可用于斑點(diǎn)免疫測(cè)定。ECA放大系統(tǒng)的優(yōu)點(diǎn)是ECA試劑為預(yù)先制備，因此，操作中不增加EIA的測(cè)定步驟，此外，通過(guò)多層次ECA反應(yīng)還可進(jìn)一步增加測(cè)定的敏感性，缺點(diǎn)是對(duì)ECA試劑的制備要求較高；三種試劑之間的理想配比是成功地制備ECA試劑的關(guān)鍵。

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