β-1,3葡聚糖酶（β-1,3-GA）活性檢測試劑盒說明書
可見分光光度法
注意：本產(chǎn)品試劑有所變動，請注意并嚴(yán)格按照該說明書操作。
貨號：BC0360
規(guī)格：50T/24S
產(chǎn)品組成：使用前請認(rèn)真核對試劑體積與瓶內(nèi)體積是否一致，有疑問請及時聯(lián)系索萊寶工作人員。

溶液的配制：
試劑一：臨用前取1支加1.6 mL蒸餾水溶解，用不完的試劑2-8℃保存 4周；
標(biāo)準(zhǔn)品：10 mg無水*糖。臨用前加入1 mL蒸餾水溶解，配制成10 mg/mL葡萄糖溶液備用，2-8℃保存2周。
產(chǎn)品說明：
β-1,3-GA( EC 3.2.1.39)主要存在植物中，催化β-1,3-葡萄糖苷鍵水解。在植物染病或處于其他逆境條件下，可誘導(dǎo)細(xì)胞大量合成β-1,3-GA，因此β-1,3-GA活性測定廣泛應(yīng)用于植物病理和逆境生理研究。
β-1,3-GA水解昆布多糖，內(nèi)切β-1,3-葡萄糖苷鍵，產(chǎn)生還原末端，通過測定還原糖生成速率，來計算其酶活性。

注意：實驗之前建議選擇2-3個預(yù)期差異大的樣本做預(yù)實驗。如果樣本吸光值不在測量范圍內(nèi)建議稀釋或者增加樣本量進(jìn)行檢測。
需自備的儀器和用品：
可見分光光度計、臺式離心機、水浴鍋/恒溫培養(yǎng)箱、可調(diào)式移液器、1mL玻璃比色皿、研缽/勻漿器、超聲破碎儀、冰和蒸餾水。
操作步驟：
一、樣本處理（可適當(dāng)調(diào)整待測樣本量，具體比例可以參考文獻(xiàn)）

1. 組織：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL提取液），進(jìn)行冰浴勻漿。12000g，4℃離心10min，取上清，置冰上待測。

2. 細(xì)菌或細(xì)胞：收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；按照每500萬細(xì)菌或細(xì)胞加入1mL提取液，超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞（功率200w超聲3s，間隔10s，重復(fù)30次）；12000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測。

二、測定步驟

1. 分光光度計預(yù)熱30min 以上，調(diào)節(jié)波長至540nm，蒸餾水調(diào)零。

2. 標(biāo)準(zhǔn)品的準(zhǔn)備：將標(biāo)準(zhǔn)品用蒸餾水稀釋至1、0.8、0.6、0.4、0.2mg/mL。

3. 標(biāo)準(zhǔn)品稀釋表

實驗中每個標(biāo)準(zhǔn)管需100µL標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1. 樣本測定（在1.5mL EP 管中依次加入下列試劑）

充分混勻，沸水浴5min（蓋緊，防止水分散失），流水冷卻，540nm 處記錄各管吸光值A，ΔA=A 測定-A對照。每個測定管需設(shè)一個對照管。標(biāo)準(zhǔn)曲線和空白管只需做1-2次。
如果吸光值大于2，可以用提取液對樣本稀釋后測定（計算公式乘以相應(yīng)稀釋倍數(shù)）。
三、β-1,3-GA活性計算
1、標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立：
根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)管吸光度x（A標(biāo)準(zhǔn)管-A空白管）和濃度（y，mg/mL）建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，將ΔA帶入公式中計算出樣本中產(chǎn)生的還原糖的含量y值（mg/mL）。
2、β-1,3-GA活性計算：

1. 按蛋白濃度計算

單位的定義：每mg組織蛋白每小時產(chǎn)生1mg還原糖定義為一個酶活性單位。
β-1,3-GA活性 (U/mg prot)=(y×V1)÷(V1×Cpr)÷T=y÷Cpr

1. 按樣本質(zhì)量計算

單位的定義：每g組織每小時產(chǎn)生1mg還原糖定義為一個酶活性單位。
β-1,3-GA 活性(U/g 質(zhì)量)=(y×V1)÷(W×V1÷V2)÷T=y÷W

1. 按細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量計算

單位的定義：每1萬個細(xì)胞或細(xì)菌每小時產(chǎn)生1mg還原糖定義為一個酶活性單位。
β-1,3-GA 活性(U/10⁴ cell)=( y×V1)÷(500×V1÷V2)÷T=0.002×y
V1：加入反應(yīng)體系中樣本體積，0.1mL；V2：加入提取液體積，1mL；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g；T：反應(yīng)時間，60min=1h；500：細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù)，萬。

相關(guān)發(fā)表文獻(xiàn)：

1. X Niu,Q Xu,W Wang,et al. The antifungal activity of a thaumatin-like protein from oyster Crassostrea gigas.

Invertebrate Survival Journal. June 2018;(IF0.967)
參考文獻(xiàn)：

1. Mohammadi M, Karr A L. Beta-1, 3-glucanase and chitinase activities in soybean root nodules[J]. Journal of plant physiology, 2002, 159(3): 245.

相關(guān)系列產(chǎn)品：
BC0360/BC0365  β-1,3葡聚糖酶（β-1,3-GA）活性檢測試劑盒
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