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PEI轉(zhuǎn)染手冊
點擊次數(shù)：78737 發(fā)布時間：2011-12-13
PEI轉(zhuǎn)染手冊
轉(zhuǎn)染操作流程：
1、細胞傳代：
轉(zhuǎn)染前24h內(nèi)分離293T細胞至含10％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基 中進行傳代培養(yǎng)，接種密度如下：
6孔板：0.5x106細胞
10cm培養(yǎng)皿：4.0x106細胞
15cm培養(yǎng)皿：9.0x106細胞
2、轉(zhuǎn)染
轉(zhuǎn)染前將所有試劑置于室溫。
2.1質(zhì)粒DNA的稀釋
在無菌試管中，用無血清的DMEM W / O酚紅培養(yǎng)基（濃度為10％）稀釋質(zhì)粒DNA（ug）。病毒包裝體（psPAX2）：病毒包膜（pMD2G）和重組質(zhì)粒DNA的稀釋比例分別為4:2:1。
6孔板：200ul+3ug的DNA
10cm培養(yǎng)皿：1ml+7-8ug的DNA
15cm培養(yǎng)皿：2ml+11-12ug的DNA
2.2 轉(zhuǎn)染復合體形成
將PEI（1ug/uL）加入已稀釋的總DNA中，PEI與DNA（ug）的混合比率為3:1。加入后立即渦旋混合。
6孔板：9ul PEI復合體（1ug/ul）=9ug
10cm培養(yǎng)皿：21ul PEI復合體（1ug/ul）=21ug
15cm培養(yǎng)皿：33ul PEI復合體（1ug/ul）=33ug
將添加到細胞的DNA/ PEI的混合物在室溫下孵育15分鐘。
4、收獲轉(zhuǎn)染細胞
轉(zhuǎn)染后48小時內(nèi)收獲轉(zhuǎn)染細胞/或病毒上清。
試劑的配制：
PEI（1ug/ul）
1、將無內(nèi)毒素的無菌水加熱至80℃左右溶解PEI，冷卻到室溫。
2、調(diào)整pH值至7.0，用0.22um的濾器過濾消毒，分裝后儲存在-20℃。工作液可保持在4℃
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