常用實驗方法學(xué)

一、肝素的配制

市售肝素凍干粉是140單位/mg，1克瓶裝，每瓶140,000單位。稱取0.1克肝素凍干粉，加生理鹽水5ml，配成2800單位/ml。取50~100μl濕潤管壁，可抗凝人血3~5ml。血液不會凝固。老鼠血易凝固，所以濃一些?？梢匀?.1克肝素凍干粉，加3ml生理鹽水溶解后，取50~100μl，可抗凝鼠血2~4ml。

肝素抗凝管的制備：取0.1克肝素凍干粉，加2.5ml生理鹽水。取100μl~150μl滴入塑料或玻璃管中，濕潤管壁，低于80℃小烤箱中（可以用烤面包的小烤箱），橫向轉(zhuǎn)動，每隔5~10分鐘轉(zhuǎn)動一次，直至干燥后放入4℃保存，可使2~5ml血液不凝固。

二、組織勻漿的制備

1、取組織塊（0.2g~1g）zui少可到2~5mg在冰冷的生理鹽水中漂洗，除去血液，濾紙拭干，稱重，放入5或10ml的小燒杯內(nèi)。

2、用移液管量取預(yù)冷的勻漿介質(zhì)（ph7.4，0.01mol/L Tris-HCI，0.0001mol/L EDTA-2Na,0.01mol/L蔗糖 0.8的氯化鈉溶液）或者用0.86冷生理鹽水，勻漿介質(zhì)或者生理鹽水的體積總量應(yīng)該是組織塊重量的9倍，用移液管或移液器取總量2/3的勻漿介質(zhì)或者生理鹽水于燒杯中，用眼科小剪盡快剪碎組織塊（天熱時操作要在冰水浴中進行，將盛有組織的小燒杯放入冰水中）。

3、勻漿的方式有多種：手工勻漿，機器勻漿，超聲粉碎，反復(fù)凍融。

①手工勻漿：將剪碎的組織倒入玻璃勻漿管中，再將剩余的1/3勻漿介質(zhì)或冷生理鹽水沖洗殘留在燒杯中的碎組織塊，一起倒入勻漿管中進行勻漿，左手持勻漿管將下端插入盛有冰水混合物的器皿中，右手將搗桿垂直插入套管中，上下轉(zhuǎn)動研磨數(shù)十次（6~8分鐘），充分研碎，使組織勻漿化。

②機器勻漿：用組織搗碎機10000~15000r/min上下研磨制成10組織勻漿，也可用內(nèi)切式組織勻漿機制備（勻漿時間10秒/次，間隙30秒，連續(xù)3~5次，在冰水中進行），皮膚、肌肉組織等可延長勻漿時間。

③超聲粉碎：用超聲粉碎機進行粉碎，可用Soniprep型超聲波發(fā)生器以振幅14微米超聲處理30秒使細胞破碎，也可用國產(chǎn)超聲波發(fā)生儀，用400安培，5秒/次，間隙10秒反復(fù)3~5次。

④反復(fù)凍融：培養(yǎng)或者分離的細胞可以用以上①②③的方法勻漿，也可以反復(fù)凍溶3次左右（即讓細胞加適量的低滲液或者雙蒸水放低溫冰箱中結(jié)冰，溶解，再結(jié)冰，再溶解。反復(fù)3次左右），但有部分酶活力會受影響。

⑤取少量組織勻漿作涂片（直接涂片、染色均可以），顯微鏡下觀察細胞是否磨破，若沒有破則可延長勻漿時間或增加凍溶次數(shù)（此步可省略）。

4、將制備好的10勻漿用普通離心機或低溫低速離心機2000r/min左右離心10~15分鐘，若檢測ATP酶，則只需要1000轉(zhuǎn)/分，離心5分鐘，將離心好的勻漿留上清棄下面的沉淀。

根據(jù)你的實驗需要，取適量上清液進行各種測定。

三、線粒體及微粒體的提取

（一）制備10的組織勻漿（制備方法見上述組織勻漿的制備1、2、3）

（二）制備線粒體：取10組織勻漿，用普通離心機或低溫低速離心機以1000~2000r/min離心10分鐘，棄沉淀，取上清液以8000~10000r/min（低溫高速離心機）離心15分鐘，沉淀物位線粒體。

（三）胞漿部分：分離線粒體后的上清液即為胞漿。

（四）制備微粒體：取分離線粒體后的上清液即胞漿，以144000g即40000r/min離心30分鐘，沉淀物為微粒體。

（五）將分離的線粒體或微粒體分別用冰冷的勻漿介質(zhì)制備成混淆液，用手工勻漿或機器勻漿使線粒體會微粒體破碎，或者用somiprep150型超聲發(fā)生器以振幅14微米超聲處理30秒，或者用國產(chǎn)超聲波發(fā)生儀，400安培，5秒/次，間隙10秒反復(fù)3~5次。使線粒體或微粒體破碎，待測酶活力，也可用反復(fù)凍融的方法使其破碎，但有部分酶活力會受影響。

（六）制備好的線粒體、微粒體、胞漿部分可根據(jù)您的需要分別進行各種測定。

四、線粒體的鑒定（中性紅—詹納斯綠B染色）

在兩張干凈載玻片*各滴2~3滴中性紅—詹納斯綠B染液，待其中的酒精蒸發(fā)*后，用牙簽挑少許沉淀物均勻涂布在一張玻片的染液中；另取上清液一滴，混于另一張玻片的染液中，兩片分別蓋上蓋玻片，染色5分鐘，在高倍鏡下觀察，被染成亮綠色顆粒即線粒體。

中性紅—詹納斯綠B染色的配制：

A液：取詹納斯綠B（Jana’s green B）飽和水溶液（溶解度5.18）3滴滴入5ml無水乙醇中，混勻。

B液：取飽和中性紅（Neu—tral red）水溶液（10mg中性紅溶于150ml蒸餾水中，并用黑紙包好貯冰箱）20~30滴滴入5ml無水乙醇中，混勻。

用時將A液和B液呼喝即成中性紅—詹納斯綠B染液（混合液中的燃料部穩(wěn)定會在24小時內(nèi)發(fā)生沉淀）。

注：1、若發(fā)現(xiàn)涂片上有成團的染料可將詹納斯綠B3滴改成1滴或2滴，而將中性紅20~30滴改成10~20滴。

2、本研究所線粒體制備方法較為成熟，一般不需要染色鑒定。

五、勻漿介質(zhì)的制備

配制1000mlpH7.4，0.01mol/L Tris-HCI,0.0001mol/L EDTA-2Na,0.01mol/L 蔗糖，0.8氯化鈉溶液。

三劉甲基氨基甲烷 Tris   分子量121.14， 乙二胺四乙酸二鈉EDTA  分子量372.24，

蔗糖  分子量342.3

稱取  Tris             121.4*0.01=1.21g

          EDTA-2Na       372.24*0.0001=37.23mg

          蔗糖            342.3*0.01=3.42g

          氯化鈉          8克

將Tris 1.21g及EDTA·2Na 37.23mg加水500ml，再用200mmol/L HCI進行滴定至pH7.4，然后加入3.42克蔗糖，8克氯化鈉，再用蒸餾水補充至1000ml，放入鹽水瓶中，以9磅壓力進行消毒或者微波爐消毒3~5分鐘后放4℃冰箱中備用（也可用生理鹽水代替勻漿介質(zhì)）。

六、紅細胞中SOD的抽提

1、采集手指血、或肝素抗凝的靜脈血或動脈血50µ1[注1]，沖入盛有2～4ml的生理鹽水的帶刻度離心管中，2000轉(zhuǎn)/分 離心3分鐘。

2、用玻璃吸管吸去上清液（要吸干凈），留沉淀的紅細胞。

3、加入預(yù)冷的雙蒸水0.2ml，混勻（使紅細胞溶解）

4、加入95乙醇0.1ml，振蕩30秒。

5、加入三氯甲烷（氯仿）0.1ml置漩渦混勻器充分混勻（抽提）一分鐘。

6、3500轉(zhuǎn)/分 離心8分鐘。

   此時液體分三層：上層為SOD抽提液，中層為血紅蛋白沉淀物，下層為三氯甲烷。若上清有渾濁可加入少量固體NaCl后再離心5分鐘，即可澄清。

記錄上清液體積，取5～20µ1作SOD測定[注2]

[注1]：大、小鼠可取內(nèi)眥血，用玻璃毛細管從眥部斜向咽喉方向刺入，或者剪尾取血，將血滴在含肝素并烤干的玻片上（烤干時溫度要低于80℃），再用移液器取50µ1血，作SOD抽提。血量少時可取10～20µ1抗凝全血（做慢性動物試驗，在飼養(yǎng)過程中可以反復(fù)取血5～6次。

[注2]：紅細胞中只有銅鋅SOD，沒有錳SOD。

七、紅細胞膜的制備

  1、原理和應(yīng)用  哺乳動物細胞是生物質(zhì)膜zui方便，的來源，除來源廣泛以外，這種細胞還不含任何細胞器，從而可以得到一種純凈的細胞質(zhì)膜。紅細胞血影（ghost）膜主要是采用低滲透處理來獲得的，在低滲介質(zhì)中，紅細胞膨脹，由雙面盤狀變成近乎球形，隨后細胞內(nèi)容物包括血紅蛋白成分因細胞破裂而釋放出來。zui后，通過離心沉淀技術(shù)可獲得純凈的紅細胞膜（又稱紅細胞血影膜）。

2、儀器和設(shè)備：常速離心機和低溫高速離心機。

3、試劑（建成生物工程研究所可訂購）

（1）等滲緩沖液（本所有售）

（2）低滲緩沖液（本所有售）