DNA印跡法(Southern blot, SB)

SB已廣泛應(yīng)用于分析DNA和端粒結(jié)構(gòu). 用限制性核酸內(nèi)切酶Hin fⅠ或Rsa Ⅰ消化DNA, 然后瓊脂糖電泳分離不同大小的片段, 轉(zhuǎn)移到硝酸纖維或尼龍膜上. 用32P同位素或生物素、堿性磷酸酯酶標(biāo)記的端粒特異探針與其雜交(CCCATT)n. 末端限制酶切片段(TRF)通過光密度計定量測量. 選用Hin fⅠ或Rsa Ⅰ是因為這兩種酶能頻繁的切斷DNA, 使亞端粒區(qū)域變得盡可能小. 用于SB分析的DNA應(yīng)該是沒有被打碎和純度較高的, 但是因為DNA的高分子量、高黏度使得這點較難保證. TRF法得到的數(shù)據(jù)除代表所有染色體端粒的長度外, 還包括部分亞端粒區(qū)長度. 因此TRF法不能提供端粒的實際長度.

雜交保護分析法(hybridization protection assay,HPA)

HPA需要制備基因組DNA、細(xì)胞或組織溶胞產(chǎn)物同吖啶酯(AE)標(biāo)記端粒的探針進行雜交, 檢測發(fā)光強度, 確定端粒在Alu序列中比例. 研究表明, Alu序列中比例為0.01的端粒大約與2 kb的TRF法測量的端粒長度對應(yīng). HPA不需要完整的或沒有修剪的DNA, 但是, 推薦使用下限為10 ng修剪過的DNA. 純化的細(xì)胞DNA或至少含有1000個細(xì)胞的組織溶胞產(chǎn)物都能用于測量. 雖然HPA不包括亞端粒序列, 但是HPA法沒有給出詳細(xì)的細(xì)胞或染色體水平的端粒信息,也不能直接測定端粒長度.

熒光原位雜交(FISH)

FISH直接將寡核苷酸探針標(biāo)記在端粒序列上. 標(biāo)準(zhǔn)的FISH包括制作分裂中期的染色體以及DNA變性, 與異硫氰酸熒光素(FITC)或Cy3標(biāo)記的寡核苷酸探針雜交, 用DAPI或PI復(fù)染, zui后用熒光顯微鏡檢測信號. FISH方法被廣泛地應(yīng)用于特定基因的細(xì)胞遺傳學(xué)研究. FISH自身的特點使其適合于測定端粒長度, 如小的端粒探針可增加進入細(xì)胞的滲入度, 而且單鏈探針不需要退火.幾種改良的FISH: 用FISH方法進行的端粒定量被稱作Q-FISH[14-15](Quantitative-FISH). Lansdorpet al用核酸肽(PNA)寡核苷酸探針(PNAFISH)代替寡核苷酸探針改良了Q-FISH法. 因為帶電的脫氧核糖酸鹽主鏈被肽鏈連接的不帶電N-(2-氨基乙基)-甘氨酸主鏈替代, PNA探針的復(fù)式結(jié)構(gòu)遠(yuǎn)比DNA/DNA或DNA/RNA的穩(wěn)定.結(jié)合FISH和免疫染色(I-FISH)的方法可以測量用甲醛固定,石蠟包埋的人組織樣本的端粒,同時還可以鑒別細(xì)胞種類. 在I-FISH中只需用很少的細(xì)胞, 這種方法可以忽略不同細(xì)胞種類而直接比較正常和癌變細(xì)胞的端粒長度. Perneret al發(fā)明了端粒/著絲粒-FISH(T/C-FISH)測量每個單獨的染色體臂的端粒長度的方法, 2號染色體著絲粒作內(nèi)參. 熒光強度的比率經(jīng)過計算同TRF法有很好的相關(guān)性. Yan et al 在染色質(zhì)/DNA纖維制備中應(yīng)用了Fiber-FISH法. 端粒的特異PNA Green探針和1q亞端粒的特異Red探針在染色質(zhì)纖維上同時雜交, 已知的1q亞端粒探針大小為100 kb. 因為解壓縮的染色質(zhì)的可變伸縮性使得纖維雜交的時候顯色長度變得可變. 然而, 目的序列同亞端粒探針有相似的伸縮程度. 因此, 用已知大小的亞端粒探針作對照對判斷DNA纖維解壓縮的程度起很重要的作用. 在檢測淋巴母細(xì)胞系1q時, 端粒和亞端粒排列在纖維上的信號范圍分別在0.9 μm-2.9 μm和13.8-29 μm之間. 這意味著根據(jù)纖維的不同伸展程度雜交到纖維上的探針可見長度為3.4-7.2kb/μm(平均5.5 kb/μm) .

流式細(xì)胞計量-熒光原位雜交(Flow-FISH)

Flow-FISH包括6個基本步驟: 細(xì)胞分離, DNA變性并與PNA探針雜交, 洗去多余探針, 復(fù)染后用流式細(xì)胞計量術(shù)采集和分析.來自不同細(xì)胞系和臨床樣本的骨髓、血液淋巴結(jié)、經(jīng)過檢測的扁桃體的端粒長度值同TRF法有很好的相關(guān)性. 同Q-FISH相反, Flow-FISH可以分析周期中和非周期中的細(xì)胞端粒, 整個操作只需1d. 此外, 不同的細(xì)胞亞群能夠同時處理, 這對于分析較難純化的細(xì)胞是很有用的. Flow-FISH法測定端粒長度在研究有核血細(xì)胞在正常個體和病態(tài)個體的血液病時有很高的實用性.Flow-FISH同時分析端粒長度和細(xì)胞表型的技術(shù)難度很高, 因為只有很少的帶有合適發(fā)射光譜的熒光染料能承受DNA變性和PNA雜交的條件. Baerlocher et al運用Hydra 96孔微型分注器測量端粒長度, 他可以定量差異很小(0.5kb)的端粒片段, 而且只用很少的細(xì)胞(1000個).當(dāng)同時測量復(fù)雜樣品時, 這種自動化操作盡顯優(yōu)勢.

寡核苷酸引物原位DNA合成法(PRINS)

寡核苷酸引物(CCCTAA)7與分裂中期或分裂間期的同源染色體退火、雜交, 加入熱穩(wěn)定DNA聚合酶和熒光標(biāo)記的核苷酸后引物開始延伸,zui終通過熒光顯微鏡分析熒光信號.許多位點的引物同時擴增保證了充足的熒光信號得以檢測,但是不均勻的引物退火可能導(dǎo)致端粒長度測量不充分. 一些用于增加標(biāo)記和退火功效的改良, 雙脫氧核苷酸的參與可以通過減少染色體被隨機打斷的非相關(guān)DNA的擴增而使更多特異端粒序列被標(biāo)記. zui近, Yan et al用雙鏈PRINS法, 即(TTAGGG)7和(CCCTAA)7兩個引物標(biāo)記端粒DNA的正鏈和反鏈.兩個方向的標(biāo)記使產(chǎn)物的信號得以加強, 標(biāo)記功效增加到78%至95%.

定量PCR

以前認(rèn)為用寡核苷酸引物TTAGGG和CCCTAA進行的PCR反應(yīng)不可能用于測量端粒, 因為引物自身之間可能發(fā)生雜交.但是如果引物被加以修飾, 6個重復(fù)堿基中包括兩個錯配堿基和4個連續(xù)配對堿基, 這樣兩個引物便不會互相雜交. 在Q-PCR中端粒(T)重復(fù)拷貝的比例同單個拷貝的基因(S)的比例是確定的. T/S的比例同端粒平均長度成正比關(guān)系,端粒長度可根據(jù)T/S率測定.

單個端粒長度分析(SA)

SA是在單個染色體水平上基于PCR的端粒測量方法.

第1步是“orette”(在與端粒G懸突不配對的20個核苷酸后有7個同源的TTAGGG接頭)的退火.第2步是將“orette”連接到富C鏈5末端.此后用識別orette尾巴的tail引物同亞端粒上游引物進行PCR擴增.在研究這個區(qū)域的多態(tài)現(xiàn)象時, 上游引物可以是特異的等位基因. SAzui先被用于分析人類X染色體短臂. zui近對秀麗隱桿線蟲的端粒和沃納綜合征的成纖維細(xì)胞的端粒的研究表明, 在單個染色體水平上SA的分析有很高的可靠性.SA的PCR擴增具有高度的端粒特異性, 用SA測量人類成纖維細(xì)胞的XpYp端粒長度始終比TRF的平均值小, 且這兩者成線性關(guān)系, 說明SA沒有包括亞端粒長度.