牛人實(shí)驗(yàn)經(jīng)驗(yàn)，都是細(xì)節(jié)

 用常溫或者高溫預(yù)熱過（預(yù)熱更有利于阻止蛋白水解或者磷酸酶去磷酸化，但容易遺忘，LB久煮某些性質(zhì)會(huì)改變）的1*SDSLB（或者略高1.5*）直接加到細(xì)胞或者組織上并煮樣。通常6孔板細(xì)胞80%以上密度，需200ul，其他按平板面積比類推。通常條件下，SDSLB都是過量的（因此不一定要嚴(yán)格參考SDS LB稀釋比）；如果SDSLB不夠，樣品核酸、蛋白濃度過高時(shí)，煮樣后會(huì)發(fā)現(xiàn)tip吸不上來，非常粘、一砣一砣的，很容易堵住tip。這時(shí)候常規(guī)做法有兩種，1.再煮5min。常規(guī)煮樣時(shí)間3-5min，樣品過濃時(shí)就煮10min；2.如果10min煮樣后，仍然吸不起來，才適當(dāng)增加SDSLB，繼續(xù)煮；也可以對(duì)樣品進(jìn)行超聲。煮樣時(shí)間若過長(zhǎng)，蛋白會(huì)凝固，此時(shí)以失去繼續(xù)WB的意義，請(qǐng)丟棄（判斷標(biāo)準(zhǔn)：出現(xiàn)明顯的蛋白沉淀和水分層）
此方法的缺點(diǎn)，SDS LB煮過的樣品如果用來做IP，需要特殊方法，因此，這種制備方法制備的樣品有使用局限。

非變性裂解法（不討論諸如核抽提、亞細(xì)胞器分離等等了，其實(shí)類似）
裂解細(xì)胞請(qǐng)盡量冰上操作，減緩酶解作用。
俺前boss nature文章上的裂解液配方是：20mM Tris/HCl, pH7.6, 100mM NaCl, 20mM KCl,1.5mM MgCl2, 0.5% NP-40 and protease inhibitors （20μg/ml leupeptin,10μg/ml pepstatin A and 10 μg/mlaprotinin）（此裂解液可用于抽提核蛋白），其中蛋白酶抑制劑很復(fù)雜也很貴，其實(shí)用0.5mMPMSF替代這三種就好了；如果還要做磷酸化蛋白，加1mM Na3VO4（現(xiàn)加現(xiàn)用），10 mM NaF, 1 mM Na3VO4, 50 mMbeta-GP。
此方法的優(yōu)點(diǎn)：NaCl濃度略低于生理狀態(tài)，保證裂解細(xì)胞的方式較為溫和，便于隨后的IP等試驗(yàn)。其他Na鹽濃度的細(xì)胞裂解液也很常見，諸如0.15M（生理鹽濃度）、0.3M、0.6M（高鹽系列，裂解細(xì)胞時(shí)染色體會(huì)析出，細(xì)胞碎片和沉淀非常粘稠）及0.8-1.2M；0.3M及以下適合IP試驗(yàn)，0.6M及以上適合純化蛋白，尤其相互作用較強(qiáng)的復(fù)合體，要得到純化的一些復(fù)合體的組成蛋白一般采用的高鹽裂解細(xì)胞。
用于核蛋白的裂解的原因是0.5% NP-40，用于破壞核膜結(jié)構(gòu)；可用到1%，但此時(shí)染色體會(huì)析出，沉淀粘稠。

組織塊裂解：
組織塊較大用勻漿的方法zui合適，現(xiàn)在有不少轉(zhuǎn)頭很小的勻漿器。
當(dāng)組織超微量的時(shí)候，比如50mg新鮮癌組織，我采用的方法是
1. 低溫（剪）攪碎，成肉糜狀。
2. 錫箔紙包裹好，放入少量液氮，快速敲擊（控制力量，盡量避免弄破錫箔紙），進(jìn)一步破碎；反復(fù)多次。
3. 用上述細(xì)胞裂解液回收。

分泌型蛋白富集：
    用無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞，收集上清液用于WB檢測(cè)；如果含量過低，需要用TCA沉淀富集。
理論上，從普通培養(yǎng)基中收集分泌蛋白，此時(shí)對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)條件的影響zui小，是*的實(shí)驗(yàn)條件；但是這存在隱憂。因?yàn)楹宓呐囵B(yǎng)基中含有非常豐富的BSA（牛血清白蛋白）之類的蛋白質(zhì)，除非你進(jìn)一步分離純化，否則直接用這種樣品去WB會(huì)有非常大的麻煩，尤其當(dāng)你的蛋白在60-46kDa之間的時(shí)候；用“任何”抗體去檢測(cè)這一區(qū)間的蛋白，會(huì)有一片非常強(qiáng)的信號(hào)。因?yàn)榇藚^(qū)間蛋白（主要是BSA）濃度過于富集，會(huì)非特異性粘附“任意”抗體，從而zui終被識(shí)別。同理，采用SDS LB裂解細(xì)胞制備樣品前，通常要用PBS洗滌，其目的之一是去除培養(yǎng)基中的BSA。
采用無血清培養(yǎng)基收集細(xì)胞上清除了改變細(xì)胞的生理狀態(tài)外（可能激活未知信號(hào)途徑，諸如AKT等），還會(huì)出現(xiàn)的問題是：
1. 即使采用了無血清收集上清，仍然有大量雜蛋白，但相對(duì)好很多。
2. 選用了上清，由于蛋白濃度太稀，通常要采用TCA沉淀富集，再重新溶解。
a. TCA沉淀對(duì)半定量操作要求非常高，因?yàn)楹苋菀壮恋聿怀浞只蛘唠x心操作丟失，尤其在離心過程，離心管的擺放非常講究，要180度翻轉(zhuǎn)離心兩次。
b。重新溶解時(shí)，由于蛋白需要在一定的鹽離子條件下才能重新溶解，你要摸索充分溶解的條件，相對(duì)麻煩。
實(shí)際上，如果你不是非常強(qiáng)調(diào)蛋白的分泌有什么生理功能，一般不建議檢測(cè)上清，尤其半定量的WB實(shí)驗(yàn)檢測(cè)不同樣品間的差異。這里面有實(shí)驗(yàn)操作細(xì)節(jié)的麻煩——經(jīng)驗(yàn)之談，我曾經(jīng)參與的cancer cell文章所研究的蛋白就是分泌型蛋白，但90%的數(shù)據(jù)是celllysis；偶爾用到上清，也只是作為富集純化該蛋白的原料，為進(jìn)一步分析做準(zhǔn)備。

樣品制備完，應(yīng)立即低溫保存（-20度短期（幾天）；-80度長(zhǎng)期；例外，IP用樣品應(yīng)直接進(jìn)行IP，避免凍融破壞蛋白質(zhì)間弱的相互作用）。SDSLB煮沸過的樣品凍融會(huì)存在另一個(gè)問題，SDS沉淀；SDS 4度就會(huì)沉淀，何況-80度。上樣前應(yīng)加熱充分溶解，否則從加樣口向下拖帶（SDSLB不夠，樣品未充分溶解也會(huì)出現(xiàn)類似拖尾；上樣過大也會(huì)）。

在樣品制備過程中，另一個(gè)需要注意的問題是，從樣品制備的起始階段就要注意定量問題；WB本身系統(tǒng)誤差有20%，太細(xì)微的差別經(jīng)常忽略不計(jì)。細(xì)胞樣品可以先計(jì)數(shù)再接種，短時(shí)間內(nèi)即使細(xì)胞生長(zhǎng)有差異也不會(huì)對(duì)WB結(jié)果影響太多。組織樣品，從腫瘤組織的大?。ǚQ重）開始，裂解液的體積都是定量的，操作過程也盡量避免蛋白損失。有人會(huì)說可以電泳前蛋白定量，我將下一節(jié)討論蛋白定量的不科學(xué)性，以及裂解液成分對(duì)定量的干擾。

蛋白電泳：

電泳膠的制備、配方、緩沖液配方，請(qǐng)參考分子克隆。經(jīng)驗(yàn)之談，8%膠zui底邊約36KDa，10%zui底邊約25KDa，12%zui底部約12KDa。8%膠可以跑300KDa-36KDa之間的任意蛋白，轉(zhuǎn)膜效率對(duì)WB結(jié)果的的影響都問題不大。12%，180KDa左右，轉(zhuǎn)膜效率對(duì)WB結(jié)果的影響都問題不大（300KDa蛋白如何，沒有嘗試過）。
電泳一般采用恒流，45mA-55mA（應(yīng)根據(jù)電泳儀器適當(dāng)調(diào)整，要注意儀器zui高限壓；此條件適合gibco modelV16型，膠寬20cm）。采用恒流的優(yōu)點(diǎn)，保證zui快速度完成電泳（電壓會(huì)逐漸增大），省時(shí)且減少擴(kuò)散；但是由于電泳速度過快時(shí)會(huì)發(fā)熱而溶膠，所以你必須想辦法散熱。散熱不好，條帶出現(xiàn)波浪狀。

注意事項(xiàng)：
1．聚丙烯酰胺的30%母液會(huì)降解，要4度避光保存。
2．APS會(huì)失效，10%APS一般保質(zhì)期才一個(gè)月左右。-20度分裝長(zhǎng)期保存。
3．注意Tris buff的PH值，以及平時(shí)所用的水的PH值。PH值改變會(huì)使帶型非常怪異，所有蛋白和溴酚藍(lán)壓成一條細(xì)線（即便在分離膠中），如果溴酚藍(lán)前有紅色染料，那么此染料彗星式拖尾從溴酚藍(lán)一直延伸到膠底部（溴酚藍(lán)此時(shí)涌動(dòng)極緩慢，位于膠中上部）
4．上下層式電泳裝置若漏液，哪邊漏液，電泳條帶往哪邊傾斜。內(nèi)外式電泳裝置漏液，則裝置處于短路狀態(tài)，液體會(huì)過熱。SDS-PAGE膠可能局部自溶，條帶扭曲、變形。
5．配膠用玻璃板和邊條應(yīng)及時(shí)洗凈。玻板未洗凈的壞處很多。盡管玻璃看似平滑，但是一些細(xì)微的凹陷處會(huì)凝結(jié)肉眼無法分辨的膠顆粒（摸上去疙疙瘩瘩），其壞處是，在該部位極易導(dǎo)致不均勻的膠塊，樣品經(jīng)過該處或電泳散熱不好，條帶變形。如果是RNA的超薄膠，膠板的顆粒會(huì)導(dǎo)致局部巨大氣泡，非常難于清除；蛋白膠也會(huì)導(dǎo)致一些小氣泡的產(chǎn)生。玻板沒洗凈的另一個(gè)壞處是，由中學(xué)物理知識(shí)可知，玻璃表面越光滑粘附越牢，未洗凈的玻板會(huì)削弱和膠體間的粘附力，拔梳子或邊條時(shí)會(huì)產(chǎn)生微小的錯(cuò)動(dòng)，膠體下部出現(xiàn)大量氣泡（夾在玻板和膠之間，這個(gè)關(guān)系不大）；嚴(yán)重的錯(cuò)動(dòng)會(huì)使上樣時(shí)，樣品從膠和玻璃之間的間隙漏光，或者甚至膠和玻板分開。為避免拔梳子時(shí)的錯(cuò)動(dòng)，可在電泳緩沖液中拔梳子（比水更好，有SDS潤(rùn)滑）。
判斷玻板是否洗干凈，用手摸一下有沒有疙疙瘩瘩的；用洗潔精之類，洗衣粉、肥皂都不好用。
6．上樣時(shí)，不要把tip深入膠孔過深（或者采用細(xì)的拉長(zhǎng)的上樣槍頭），可能會(huì)錯(cuò)開膠和玻板，樣品會(huì)泄露。
7．未加樣的孔應(yīng)添加高濃度SDS LB平衡，否則zui外側(cè)條帶會(huì)拉寬變形。通常20ul樣品（含5ul 4*SDS LB），可用8-8.5ul4*SDSLB平衡。同理，點(diǎn)marker的lane也要加入同樣體積的LB。LB若在室溫放置太久和新鮮的在比重上會(huì)有差異，在新舊LB靠近的地方，條帶會(huì)拉寬或擠壓變形。因此，同一塊膠上，煮樣及填空白所用LB應(yīng)一致。LB應(yīng)-20度保存。
8．增加上樣量不一定會(huì)提高熒光信號(hào)強(qiáng)度。增加上樣量的后果通常只能是讓你的內(nèi)參粘連，所有的蛋白條帶都扭曲變形。因?yàn)樵黾由蠘恿縵ui多只能提高幾倍，而WB靈敏度是以10的幾次冪量級(jí)的，所有目的蛋白信號(hào)的*方案就是IP富集（可特異提高目的蛋白濃度數(shù)百數(shù)千倍，并去除其它雜蛋白干擾）。增加上樣量的另一個(gè)壞處是，本來高表達(dá)的蛋白，諸如內(nèi)參，在同樣WB條件下，可能出現(xiàn)熒光灼燒式粹滅（一晃而滅）或者條帶中空。
仍以6孔板80%以上匯合度為例，細(xì)胞裂解液和SDSLB通常都是投入200ul（zui少80ul，這樣面積的培養(yǎng)板如果裂解液投入太少，回收時(shí)的損失就太大，上樣就很難做到一致），而這種濃度條件下制備的樣品，電泳時(shí)上樣量要控制在5-6ul，zui少2.5ul，zui多10ul，10ul時(shí)內(nèi)參基本已經(jīng)開始粘連成一條線，帶型出現(xiàn)波浪紋；當(dāng)然并非不可以多上樣，再多對(duì)WB結(jié)果影響不大（沒有的仍然沒有），且條帶都很丑。
9.不同樣品上樣時(shí)，可考慮將樣品體積調(diào)成一致或類似。如果一組IP樣品和一組細(xì)胞裂解液樣品，前者通常洗脫體積為15ul，剛好+5ul 4*SDSLB達(dá)到常規(guī)20ul上樣體積；后者第8點(diǎn)提到只上5ul，同樣+5ul SDS LB（比重同，不會(huì)互相擠壓），補(bǔ)加10ulDDW使總體積一致。通常這樣不同條件獲得的樣品，中間用“空白”泳道隔開（空白僅指無蛋白，仍應(yīng)加入8-8.5ul 4*SDSLB），這樣才能確保每條帶都很美觀。
10. SDSPAGE膠配好暫時(shí)不用時(shí)，需用電泳緩沖液灌滿空間（拔去梳子和底邊邊條后的間隙），用保鮮膜包裹防止液體蒸發(fā)，短期室溫或稍長(zhǎng)期4度保存。個(gè)人習(xí)慣為，灌好分離膠用飽和的正丁醇灌滿上層，保鮮膜包裹，次日再灌堆積膠。兩種方案都可以。所以如果預(yù)計(jì)次日工作量較大，可以提前灌好SDS PAGE。

樣品是否一定需要定量再上樣？——不是的，這是浪費(fèi)時(shí)間的一個(gè)操作。
我們首先來討論一下蛋白定量的科學(xué)性。
蛋白定量首先需要一個(gè)參照系（標(biāo)準(zhǔn)蛋白），參照蛋白通常選擇BSA，也就是說你所謂的定量是對(duì)應(yīng)于BSA的濃度的一個(gè)參照值。這里面存在一個(gè)問題，即忽略了蛋白折疊和空間構(gòu)象對(duì)光吸收、折射的影響；不同的蛋白折疊和構(gòu)象還會(huì)影響顏料分子的嵌入。因此你其實(shí)默認(rèn)將所有的蛋白等同于BSA在溶液中的折疊狀態(tài)、光吸收情況下，然后做出的一個(gè)相對(duì)判斷，這就存在一個(gè)“系統(tǒng)誤差”——還不算上測(cè)量誤差等等，就已經(jīng)很不準(zhǔn)確了。
其次，裂解組織或細(xì)胞的時(shí)候，那些裂解液中，某些溶劑本身會(huì)使CoomassieG250或者Bradford法（實(shí)際也是Coomassie染色）顯色，尤其是去污劑之類；例如NP40，就會(huì)使Coomassie顯藍(lán)色，可以*覆蓋掉蛋白與Coomassie作用產(chǎn)生的藍(lán)色。因此，如果你的裂解液里面含有這類物質(zhì)，所謂的蛋白定量實(shí)際是NP40顏色和蛋白染色的疊加，根本不會(huì)符合標(biāo)準(zhǔn)蛋白曲線的線性規(guī)律，自然定不準(zhǔn)。【需要說明：我目前只知道NP40會(huì)這樣，因?yàn)槲覀儚膩聿蝗ザ浚瑳]有做過更深入的研究?！?/span>
實(shí)際上保證你的內(nèi)參一致，是從樣品制備開始的，上節(jié)末尾有提到，不贅述。如果你從制備樣品時(shí)就注意過定量問題，實(shí)際上通常內(nèi)參差別不會(huì)太大。如果真的有差別，通常我們會(huì)先跑少量的樣品，目的是讓Actin或tubulin更清晰、不會(huì)粘連、不會(huì)過曝光。從而在第二輪跑正式結(jié)果前，根據(jù)*輪的內(nèi)參的熒光信號(hào)做微調(diào)，大致能做到相當(dāng)；zui多可能需要第三輪。以上的試驗(yàn)可以到0.1ul差異（我很多體外生化試驗(yàn)之前的調(diào)整酶量就是這樣進(jìn)行，此時(shí)根本不可能有足夠的蛋白讓你去定量）。當(dāng)然憑曝光強(qiáng)弱調(diào)整上樣量的前提是，你的WB技術(shù)很穩(wěn)定，很可靠，這是需要相當(dāng)多的經(jīng)驗(yàn)積累，如果你一時(shí)掌握不了，可以讓經(jīng)驗(yàn)更豐富的師兄師姐或者導(dǎo)師幫忙。
    順便提到，有人問過用Quantity One等定量軟件對(duì)光密度定量后計(jì)算差別從而調(diào)整上樣體積是否可以？——不可以。因?yàn)閃B結(jié)果經(jīng)過多重放大，計(jì)量只代表相對(duì)于對(duì)照組的相對(duì)比值，與實(shí)際比值還是有誤差，所以按計(jì)算值更改上樣量仍會(huì)出現(xiàn)偏差。
如果非要做定量的話，要注意你的裂解液配方，把每種溶劑都先加入到顯色液中嘗試一下，避免那些本身會(huì)顯色的物質(zhì)出現(xiàn)在你的裂解液中；當(dāng)然，某些物質(zhì)的去除可能影響對(duì)組織蛋白的提取。所以這是一個(gè)兩難的問題。

轉(zhuǎn)印——轉(zhuǎn)印效率對(duì)WB結(jié)果的影響并不如書本和網(wǎng)絡(luò)上宣揚(yáng)的那么大！

    首先必須澄清的是，很多時(shí)候新手會(huì)把WB結(jié)果無信號(hào)歸咎于轉(zhuǎn)膜不夠充分，實(shí)際上轉(zhuǎn)膜效率對(duì)zui終結(jié)果的影響所占比重并不高，真正取決定性因素的是抗體識(shí)別能力的強(qiáng)弱，以及如何正確使用抗體，這個(gè)問題下節(jié)討論。
有一個(gè)簡(jiǎn)單的例證，Biorad提供的3mm厚濾紙初次使用時(shí)，通常轉(zhuǎn)膜效果不理想（從預(yù)染的marker深淺可知），但對(duì)多數(shù)一般豐度的蛋白的檢測(cè)沒有任何影響（建議少用這種新濾紙做那種含量特別或者轉(zhuǎn)膜非常困難的蛋白）。沒有很好的策略可以解決這個(gè)新濾紙的問題；嘗試過浸泡（會(huì)泡爛的）、預(yù)電泳（會(huì)稍微好點(diǎn)）等等，效果均不理想。通常，zui初一兩次的使用就是用于轉(zhuǎn)一般蛋白。每次用完后清水稍微沖洗一下表面鹽分（要控制水流；水流太大，紙張會(huì)爛掉的），晾干再用；只要沒沖爛可以一直反復(fù)使用。
其次，盡管轉(zhuǎn)膜效率不起決定性作用，但由于WB的流程相對(duì)較長(zhǎng)，所以每個(gè)步驟的疊加作用會(huì)被級(jí)數(shù)放大，因此在試驗(yàn)的每個(gè)步驟我們?nèi)詴?huì)力求更好，因此以下仍會(huì)深入探討如何提高轉(zhuǎn)膜效率。

針對(duì)提高轉(zhuǎn)膜的效率，個(gè)人認(rèn)為zui先應(yīng)該考慮到的是儀器的選用。
這里不是歧視“made inChina”，國(guó)內(nèi)的廠家很少注重不斷提高自己產(chǎn)品的品質(zhì)，走低端策略，對(duì)于電泳儀這種技術(shù)含量不高的儀器倒可以湊合；但說到轉(zhuǎn)膜儀，能把一個(gè)簡(jiǎn)單的勻場(chǎng)電極做好的還真不多（就我道聽途說的，國(guó)外廠家為了使電極之間場(chǎng)強(qiáng)更加均勻，那種大塊金屬板表面是鍍過極薄的白金層）；因此轉(zhuǎn)膜效率和均勻方面孰優(yōu)孰劣不言而喻。目前，個(gè)人使用過的國(guó)產(chǎn)電轉(zhuǎn)槽（濕轉(zhuǎn)）唯Tanon仿Biorad的還可以（算替它們免費(fèi)打個(gè)廣告吧，Tanon仿bioradmini3型電泳儀，在某些方面（主要是操作）上還優(yōu)于Biorad原裝；目前我認(rèn)為“中國(guó)制造”的靈魂就是仿造并超越前者）；半干轉(zhuǎn)儀一律進(jìn)口，用過Biorad、amersham和英國(guó)公司的scie－plas。
PS：批評(píng)一下Biorad。Biorad的半干轉(zhuǎn)儀，其硬質(zhì)塑料外殼會(huì)莫名其妙的碎裂（絕非摔裂、磕碰，因?yàn)榈酌嬉话惴旁谧郎虾蟪ㄆ谛枰逑慈コ龤埩酐}漬，基本不會(huì)移動(dòng)；即便如此它自然就會(huì)碎裂），以致于其核心組件未壞的情況下，因外殼碎裂不得不報(bào)廢該儀器（其外殼里包裹電源線，外殼碎裂，電源則無法接通，導(dǎo)致儀器報(bào)廢——我們先后買過3臺(tái)都是這樣的毛病，其間間隔了3年，不能肯定近來Biorad有沒有改進(jìn)這個(gè)問題；如果沒有，我想市場(chǎng)遲早會(huì)被其他公司所取代）
對(duì)這三款產(chǎn)品，Biorad的外殼有明顯的質(zhì)量缺陷，容易過早報(bào)廢；amersham*的蜂窩式設(shè)計(jì)確實(shí)對(duì)轉(zhuǎn)膜效率有所提高，但蜂窩式使得與“三明治”的接觸面減少，電轉(zhuǎn)時(shí)散熱不太好，做大蛋白（半干轉(zhuǎn)儀也可以做大蛋白轉(zhuǎn)膜，效率確實(shí)不如濕轉(zhuǎn)，但抗體好、蛋白豐度一般時(shí)仍可采用）長(zhǎng)時(shí)程（3hrs）轉(zhuǎn)膜需要在4度冰柜或cold room進(jìn)行；英國(guó)的產(chǎn)品，價(jià)格較高，公司不太出名國(guó)內(nèi)不一定有代理，但質(zhì)量和散熱都非常好。