豬禽流感H5N1(AIV-H5N1)酶聯(lián)免疫分析

試劑盒使用說明書

本試劑盒僅供研究使用。

96T

使用目的：

本試劑盒用于測定豬血清、血漿及相關(guān)液體樣本中禽流感 H5N1(AIV-H5N1)表達(dá)。 實(shí)驗(yàn)原理

本試劑盒應(yīng)用雙抗體夾心法測定標(biāo)本中豬禽流感 H5N1(AIV-H5N1)表達(dá)。用純化的禽流感

H5N1(AIV-H5N1)抗體包被微孔板，制成固相抗體，可與樣品中禽流感 H5N1(AIV-H5N1)相 結(jié)合，經(jīng)洗滌除去未結(jié)合的抗原和其他成分后再與 HRP 標(biāo)記的禽流感 H5N1(AIV-H5N1)抗 體結(jié)合，形成抗體-抗原-抗體復(fù)合物，經(jīng)過徹底洗滌后加底物 TMB 顯色。TMB 在 HRP 酶 的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成zui終的黃色。用酶標(biāo)儀在 450nm 波長下測定 吸光度（OD 值），與 CUTOFF 值相比較，從而判定標(biāo)本中豬禽流感 H5N1(AIV-H5N1)的存 在與否。

試劑盒組成

標(biāo)本要求

1．標(biāo)本采集后盡早進(jìn)行提取，提取按相關(guān)文獻(xiàn)進(jìn)行，提取后應(yīng)盡快進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。若不能 馬上進(jìn)行試驗(yàn)，可將標(biāo)本放于-20℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融

2．不能檢測含 NaN3 的樣品，因 NaN3 抑制辣根過氧化物酶的（HRP）活性。

操作步驟

1.     編號：將樣品對應(yīng)微孔按序編號，每板應(yīng)設(shè)陰性對照 2 孔、陽性對照 2 孔、空白對照 1

孔（空白對照孔不加樣品及酶標(biāo)試劑，其余各步操作相同）

2.    加樣：分別在陰、陽性對照孔中加入陰性對照、陽性對照 50μl。然后在待測樣品孔先 加樣品稀釋液 40μl，然后再加待測樣品 10μl。加樣將樣品加于酶標(biāo)板孔底部，盡量不 觸及孔壁，輕輕晃動(dòng)混勻，

3.     溫育：用封板膜封板后置 37℃溫育 30 分鐘。

4.     配液：將 30 倍濃縮洗滌液用蒸餾水 30 倍稀釋后備用

5.    洗滌：小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置 30 秒后棄去，如此 重復(fù) 5 次，拍干。

6.     加酶：每孔加入酶標(biāo)試劑 50μl，空白孔除外。

7.     溫育：操作同 3。

8.     洗滌：操作同 5。

9.     顯色：每孔先加入顯色劑 A50μl，再加入顯色劑 B50μl，輕輕震蕩混勻，37℃避光顯色

15 分鐘.

10.  終止：每孔加終止液 50μl，終止反應(yīng)（此時(shí)藍(lán)色立轉(zhuǎn)黃色）。

11.   測定：以空白空調(diào)零，450nm 波長依序測量各孔的吸光度（OD 值）。 測定應(yīng)在加終止 液后 15 分鐘以內(nèi)進(jìn)行。

操作程序總結(jié)：

計(jì)算和結(jié)果判定：

試驗(yàn)有效性：陽性對照孔平均值≥1.00; 陰性對照平均值≤0.10

臨界值（CUT OFF）計(jì)算：臨界值=陰性對照孔平均值+0.15

陰性判定：樣品 OD 值< 臨界值（CUT OFF）者為禽流感 H5N1(AIV-H5N1)陰性 陽性判定：樣品 OD 值≥ 臨界值（CUT OFF）者為禽流感 H5N1(AIV-H5N1)陽性

。

注意事項(xiàng)

1．操作嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行，本試劑不同批號組分不得混用。

2．試劑盒從冷藏環(huán)境中取出應(yīng)在室溫平衡 15-30 分鐘后方可使用，酶標(biāo)包被板開封后如未 用完，板條應(yīng)裝入密封袋中保存。

3．濃洗滌液可能會有結(jié)晶析出，稀釋時(shí)可在水浴中加溫助溶，洗滌時(shí)不影響結(jié)果。

4． 封板膜只限一次性使用，以避免交叉污染。

5．底物請避光保存。

6．試驗(yàn)結(jié)果判定必須以酶標(biāo)儀讀數(shù)為準(zhǔn)，使用雙波長檢測時(shí)，參考波長為 630nm

7．所有樣品，洗滌液和各種廢棄物都應(yīng)按傳染物處理。終止液為 2M 的硫酸，使用時(shí)必須 注意安全。

保存條件及有效期

1．試劑盒保存：；2-8℃。

2．有效期：6 個(gè)月