Western Blot印跡技術(shù)

根據(jù)上海恒遠(yuǎn)了解。1975，Edwen Southern提出分子印跡概念。

概念：將存在于凝膠中的生物大分子轉(zhuǎn)移（印跡）于固定化介質(zhì)上并加以檢測分析的技術(shù)。目前主要應(yīng)用于DNA,RNA，蛋白質(zhì)的檢測。

蛋白質(zhì)免疫印跡法

免疫印跡法 (Western blotting) 是一種將高分辨率凝膠電泳和免疫化學(xué)分析技術(shù)相結(jié)合的雜交技術(shù)。免疫印跡法具有分析容量大、敏感度高、特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，是檢測蛋白質(zhì)特性、表達(dá)與分布的一種zui常用的方法，如組織抗原的定性定量檢測、多肽分子的質(zhì)量測定及病毒的抗體或抗原檢測等。 免疫印跡法(immunobiotting test,IBT)亦稱酶聯(lián)免疫電轉(zhuǎn)移印斑法(enzyme linked immunoelectrotransfer blot,EITB),因與Southern早先建立的檢測核酸的印跡方法 Southern blot 相類似，亦被稱為Western-blot.

應(yīng)用

1 檢測樣品中特異蛋白存在與否

2 細(xì)胞中特異蛋白的半定量分析

3 蛋白質(zhì)分子相互作用的研究

試劑準(zhǔn)備

1、SDS-PAGE試劑：見電泳實(shí)驗(yàn)。

2、勻漿緩沖液：1.0M Tris-HCl(pH 6.8)1.Oml；10%SDS 6.0ml；β-巰基乙醇 0.2ml；ddH2O 2.8ml。

3、轉(zhuǎn)膜緩沖液：甘氨酸 2.9g；Tris 5.8g；SDS 0.37g；甲醇200ml；加ddH2O定容至1000ml。

4、0.01M PBS(pH7.4）：NaCl 8.0g；KCl 0.2g；Na2HPO4 1.44g；KH2PO4 0.24g；加ddH2O至1000ml。

5、膜染色液：考馬斯亮蘭 0.2g；甲醇80ml；乙酸2ml；ddH2O118 ml。包被液（5%脫脂奶粉，現(xiàn)配）：脫脂奶粉1.0g 溶于20ml的0.01M PBS中。

6、顯色液：DAB 6.0mg；0.01M PBS 10.0ml；硫酸鎳胺 0.1ml；H202 1.0μl。

操作步驟

一蛋白質(zhì)樣品獲得：細(xì)菌誘導(dǎo)表達(dá)后，可通過電泳上樣緩沖液直接裂解細(xì)胞，真核細(xì)胞加勻漿緩沖液，機(jī)械或超聲波室溫勻漿0.5-1min。然后4℃，13,000g離心15min。取上清液作為樣品。

二電泳：制備電泳凝膠，進(jìn)行SDS-PAGE。

三轉(zhuǎn)移：（半干式轉(zhuǎn)移）

1、電泳結(jié)束后將膠條割至合適大小，用轉(zhuǎn)膜緩沖液平衡，5min×3次。

2、膜處理：預(yù)先裁好與膠條同樣大小的濾紙和NC膜，浸入轉(zhuǎn)膜緩沖液中10min。

3、轉(zhuǎn)膜：轉(zhuǎn)膜裝置從下至上依次按陽極碳板、24層濾紙、NC膜、凝膠、24層濾紙、陰極碳板的順序放好，濾紙、凝膠、NC膜對齊，每一步去除氣泡，上壓500g重物，將碳板上多余的液體吸干。接通電源，恒流1mA/cm2，轉(zhuǎn)移1.5hr。轉(zhuǎn)移結(jié)束后，斷開電源將膜取出，割取待測膜條做免疫印跡。將有蛋白標(biāo)準(zhǔn)的條帶染色，放入膜染色液中50s后，在50%甲醇中多次脫色，至背景清晰，然后用雙蒸水洗，風(fēng)干夾于兩層濾紙中保存，留與顯色結(jié)果作對比。

四免疫反應(yīng)：

1、用0.01M PBS洗膜，5min ×3次。

2、加入包被液，平穩(wěn)搖動，室溫2hr。

3、棄包被液，用0.01M PBS洗膜，5min×3次。

4、加入一抗（按合適稀釋比例用0.01M PBS稀釋，液體必須覆蓋膜的全部），4℃ 放置12hr以上。陰性對照，以1%BSA取代一抗，其余步驟與實(shí)驗(yàn)組相同。

5、棄一抗和1%BSA，用0.01M PBS分別洗膜，5min×4次。

6、加入辣根過氧化物酶偶聯(lián)的二抗（按合適稀釋比例用0.01M PBS稀釋），平穩(wěn)搖動，室溫2hr。

7、棄二抗，用0.01M PBS洗膜，5min×4次。

8、加入顯色液，避光顯色至出現(xiàn)條帶時放入雙蒸水中終止反應(yīng)。

實(shí)驗(yàn)操作

1 細(xì)胞裂解物的準(zhǔn)備；

2 細(xì)胞裂解物的蛋白定量；

3 細(xì)胞裂解物的SDS-PAGE；

4 蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)移；

6 目的蛋白質(zhì)的檢測。

免疫印跡只能檢測目的蛋白的相對含量

測定相對含量時，需要內(nèi)參照

選擇合適的反應(yīng)條件：SDS-PAGE膠濃度；轉(zhuǎn)移膜的選擇；轉(zhuǎn)移時間的選擇

注意電極的正負(fù)極

抗體反應(yīng)時，注意驅(qū)除反應(yīng)袋內(nèi)氣泡

操作要輕柔。