實(shí)驗(yàn)操作因素對ELISA結(jié)果的影響（詳細(xì)版）

ELISA 測定一般遵循以下步驟: 固相包被→加樣品→溫育→洗滌→加酶結(jié)合物→溫育→洗滌→加底物→溫育→顯色→終止顯色→比色

目前各種形式的ELISA 自動分析儀已經(jīng)進(jìn)入市場, 如廣泛應(yīng)用于血站系統(tǒng)的微板式全自動酶免分析儀, 其試劑為開放式的, 而對于其它類型的, 則試劑和儀器往往是配套的。但當(dāng)前大部分醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室均采用手工操作加儀器測定的方式。ELISA 操作步驟復(fù)雜, 操作不當(dāng)將引起較大的誤差。以下敘述各個步驟中的影響因素。加樣器是一種比較精密的工具, 其在長時間使用時會因機(jī)械磨損或者推動桿內(nèi)附著血痂等原因造成加樣不準(zhǔn), 尤其是對于樣本量較大的臨床實(shí)驗(yàn)室, 因此必須定期對加液器進(jìn)行維護(hù)和校準(zhǔn)。每次加不同的標(biāo)本時均需更換吸嘴, 以免發(fā)生交叉污染。加樣時速度不可太快, 避免將標(biāo)本加在孔壁上部, 并注意不要濺出或產(chǎn)生氣泡。加樣時還應(yīng)當(dāng)注意操作時差對結(jié)果的影響, 操作時差是指加入標(biāo)本、試劑及混勻時間的差異。操作時差在每個實(shí)驗(yàn)中都存在, 尤其是手工操作, 日常檢測標(biāo)本多達(dá)幾百個,從加入*個標(biāo)本到zui后一個標(biāo)本, 需幾十分鐘, 加入試劑及混勻等均存在著前后時間差異, 使抗原抗體反應(yīng)和酶促反應(yīng)時間不一致, 操作時差對競爭法檢測的結(jié)果影響更大, 在加酶結(jié)合物和底物時可用定量多道。

正式試驗(yàn)時，應(yīng)分別以陽性對照與陰性對照控制試驗(yàn)條件，待檢樣品應(yīng)作一式二份，以保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。有時本底較高，說明有非特異性反應(yīng)，可采用羊血清、兔血清或BSA等封閉。ELSIA操作步驟復(fù)雜，影響反應(yīng)因素較多，特別是固相載體的包被難達(dá)到各個體之間的一致，因此在定量測定中，每批測試均須用一系列不同濃度的參考標(biāo)準(zhǔn)品在相同的條件下制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。測定大分子量物質(zhì)的夾心法ELISA，標(biāo)準(zhǔn)曲線的范圍一般較寬，曲線zui高點(diǎn)的吸光度可接近2.0，繪制時常用半對數(shù)紙，以檢測物的濃度為橫坐標(biāo)，以吸光度為縱坐標(biāo)，將各濃度的值逐點(diǎn)連接，所得曲線一般呈S形，其頭、尾部曲線趨于平坦，中央較呈直線的部分是的檢測區(qū)域。

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