應(yīng)用簡(jiǎn)介
       DNA甲基化是基因表達(dá)調(diào)控的一種重要機(jī)制，DNA甲基化檢測(cè)是指利用各種方法對(duì)腫瘤細(xì)胞DNA甲基化程度進(jìn)行測(cè)定。在惡性腫瘤的發(fā)展中，甲基化的狀態(tài)并不是一成不變，腫瘤細(xì)胞內(nèi)全基因組的低甲基化程度與疾病進(jìn)展、腫瘤大小和惡性程度都有密切的關(guān)系，DNA甲基化檢測(cè)對(duì)腫瘤惡性程度的判斷有重要意義。
技術(shù)原理
       DNA甲基化是基因表達(dá)調(diào)控的一種重要機(jī)制，DNA甲基化檢測(cè)是指利用各種方法對(duì)腫瘤細(xì)胞DNA甲基化程度進(jìn)行測(cè)定。在惡性腫瘤的發(fā)展中，甲基化的狀態(tài)并不是一成不變，腫瘤細(xì)胞內(nèi)全基因組的低甲基化程度與疾病進(jìn)展、腫瘤大小和惡性程度都有密切的關(guān)系，DNA甲基化檢測(cè)對(duì)腫瘤惡性程度的判斷有重要意義。
       甲基化特異性的PCR（Methylation-specificPCR，MSP）
       Herman等（1996）在使用重亞硫酸鹽處理的基礎(chǔ)上新建的一種方法。該方法敏感性高，主要用于作定性研究。用亞硫酸氫鹽處理基因組DNA，所有未發(fā)生甲基化的胞嘧啶被轉(zhuǎn)化為尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不變；隨后設(shè)計(jì)針對(duì)甲基化和非甲基化序列的引物進(jìn)行PCR。通過電泳檢測(cè)MSP擴(kuò)增產(chǎn)物，如果用針對(duì)處理后甲基化DNA鏈的引物能得到擴(kuò)增片段，則說明該位點(diǎn)存在甲基化；反之，說明被檢測(cè)的位點(diǎn)不存在甲基化。 
       特點(diǎn)：適用范圍廣，能夠檢測(cè)特異位點(diǎn)是否發(fā)生甲基化。
       亞硫酸氫鹽測(cè)序法（BisulfitesequencingPCR，BSP）
       亞硫酸氫鹽修飾后測(cè)序法（BSP）Frommer等（1992）提出的研究DNA甲基化方法，此方法可靠性及精確度高，能明確目的片段中每一個(gè)CpG位點(diǎn)的甲基化狀態(tài)。用亞硫酸氫鹽處理基因組DNA，所有未發(fā)生甲基化的胞嘧啶被轉(zhuǎn)化為尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不變。隨后設(shè)計(jì)BSP引物進(jìn)行PCR，在擴(kuò)增過程中尿嘧啶全部轉(zhuǎn)化為胸腺嘧啶，最后對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序就可以判斷CpG位點(diǎn)是否發(fā)生甲基化，稱為BSP-直接測(cè)序法。將PCR產(chǎn)物克隆至載體后進(jìn)行測(cè)序，可以提高測(cè)序成功率，這種方法稱為BSP-克隆測(cè)序法。
       特點(diǎn)：精確度高，能夠準(zhǔn)確檢測(cè)出甲基化的程度百分比。
實(shí)驗(yàn)方法

常見問題
       怎樣確定基因的目標(biāo)區(qū)域來進(jìn)行甲基化分析呢？
       轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)附近的CpG島進(jìn)行DNA甲基化分析的shuo選區(qū)域，一般位于啟動(dòng)子或者5‘UTR區(qū)。
       為什么文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)的甲基化序列不在CpG島中？
       沒有明顯的CpG島不代表就沒有甲基化，甲基化也可能發(fā)生在并不密集的CG區(qū)域。
       BSP甲基化擴(kuò)增得到的PCR產(chǎn)物可否直接測(cè)序，為什么需要構(gòu)建TA克隆后測(cè)序？
       如果進(jìn)行PCR產(chǎn)物測(cè)序就有可能在原有的C位點(diǎn)得到雙峰圖，無(wú)法確定甲基化的程度。