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技術(shù)文章

土壤微生物(細菌、霉菌)實驗原理步驟

閱讀:996          發(fā)布時間:2023-12-26

一、實驗原理

1.細菌簡單染色

利用單一染料對菌體進行染色的方法叫做簡單染色。

2.細菌的革蘭氏染色 

經(jīng)此法染色后,細胞保留初染劑藍紫色的細菌為革蘭氏陽性菌;細胞中初染劑被脫色劑洗脫而染上復染劑的顏色(紅色)的細菌為革蘭氏陰性菌。

3.細菌芽孢染色 

首先用著色能力較強的染料,如孔雀綠(malachite green)或堿性品紅(basicfuchsin)在加熱條件下進行染色時,此染料不僅可以進入菌體,而且也可以進入芽孢,進入菌體的染料可經(jīng)水洗脫色,而進入芽孢的染料則難以透出。再用對比度大的復染劑(如番紅液)染色后,菌體染上復染劑顏色,而芽孢仍為原來的顏色,這樣就可以將兩者區(qū)別開來。 

4.細菌的生理生化實驗 

糖發(fā)酵試驗是常用的鑒別微生物的生化反應

甲基紅試驗是用來檢測由葡萄糖產(chǎn)生的有機酸,如甲酸、乙酸、乳酸等。 

5.真菌的觀察及鑒定 

將培養(yǎng)物直接置于顯微鏡下可觀察到霉菌自然生長狀態(tài)并可連續(xù)觀察不同時期發(fā)育期的菌體結(jié)構(gòu)特征的變化。

 

、實驗步驟 

1、土壤菌群分離 

1.1、滅菌準備

配制牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基和 PDA 培養(yǎng)基,分別裝入三角瓶中,封好。將內(nèi)裝 90ml 的蒸餾水和玻璃珠若干的三角瓶、已配好的培養(yǎng)基、涂布棒、移液管六支、試管(內(nèi)裝 9ml 蒸餾水)六支、平皿若干放入滅菌鍋中滅菌。

1.2、梯度稀釋

稱取土壤樣品 10g 加入 90ml 滅菌水中振蕩,直至土壤大顆粒被全打碎,然后靜置 30 分鐘以上,使其澄清。實驗時要保持無菌操作,防止雜菌污染土壤菌液。梯度稀釋是將原液按照十倍的等級進行稀釋,在無菌的條件下,用移液管一取 1ml 上清液加入裝有 9ml 滅菌水試管中振蕩,將其稀釋為 10-1倍,用不同的移液管依次從已稀釋的菌液中取液,將菌液梯度稀釋為原液的 10-1、10-2、10-3、10-410-5倍,分別為-1、-2、-3、-4-5 梯度,分別表示稀釋原液用 0表示。

1.3、涂布平板

將冷卻至 50-55℃的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基和 PDA 培養(yǎng)基倒平板,平板固定后進行涂布。在無菌條件下,用對應編號的移液管取菌液加到平板中,然后用涂布棒將其在平板鋪勻。細菌培養(yǎng)基對 0-2、 -4-5 梯度進行涂布,霉菌培養(yǎng)基對 0、 -3 梯度進行涂布。每梯度涂 3 個平板。

1.4、恒溫培養(yǎng) 

將霉菌培養(yǎng)基放入 27℃恒溫箱中培養(yǎng) 3 天,將細菌培養(yǎng)基平板置于 37℃恒溫培養(yǎng) 24 小時。 

1.5菌落統(tǒng)計

對不同梯度的平板進行觀察,選擇合適梯度進行菌落計數(shù),一般每平板 30 個為宜。此次試驗中,細菌培養(yǎng)基上-4 梯度為最佳。霉菌培養(yǎng)基中-3 梯度為最佳。在細菌培養(yǎng)基中,根據(jù)菌落形態(tài)的不同選取 5 種菌,考慮到可能有的菌相同,本組選取了6 種菌,對其進行觀察,描述菌落形態(tài)。選擇三種霉菌,對其編號。

1.6、畫線分離

配制牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基和 PDA 培養(yǎng)基,滅菌(滅菌鍋:山東興華)后倒取平板,將選出的菌進行劃線分離,考慮到菌數(shù)多,平板不足,每種菌只劃兩個平板。劃好后分別放入相應恒溫箱中培養(yǎng)。

 

2、細菌的純化及鑒定 

2.1、細菌純化及保藏

配制培養(yǎng)基,在不同菌劃線的培養(yǎng)基中挑取單個菌落進行再次劃線,直至菌種全純化。

制備試管斜面,將菌劃斜面培養(yǎng)留種。

2.2 、細菌形態(tài)觀察

對各菌進行制片,進行單染色觀察其形態(tài)

2.3革蘭氏染色

為鑒定細菌的革蘭氏反應對菌進行革蘭氏染色,染色前先將進行標準株培養(yǎng),標準株為大腸桿菌(革蘭氏陰性菌)、金黃色葡萄球菌(革蘭氏陽性菌),將標準株與純化的八株菌進行培養(yǎng) 12-18 小時,這樣無芽孢的產(chǎn)生,可以防止其影響染色結(jié)果。染色完成后進行鏡檢。

2.4、穿刺實驗 

穿刺實驗是對菌是否有鞭毛進行鑒定的十分有效的方法。 

配制細菌穿刺培養(yǎng)基,該培養(yǎng)基與細菌培養(yǎng)基大體相同,將其中的瓊脂減少的原來的一半 

即為半固體穿刺培養(yǎng)基。

1)將培養(yǎng)基配好后加熱(微波爐),使其全融化,略微冷卻后倒入試管中,密封后滅菌。

2)冷卻固定后,在無菌(超凈工作臺:內(nèi)循環(huán)風,蘇凈安泰)操作下,用接種針將各菌穿刺接種到半固體培養(yǎng)基中,穿刺時盡量要直,避免劃壞培養(yǎng)基。

3)將接種好的穿刺培養(yǎng)基放入 37℃的恒溫箱中培養(yǎng) 24 小時。

2.5細菌芽孢染色

1) 制片 

按常規(guī)涂片、干燥、固定。

2) 染色

加數(shù)滴 5%孔雀綠染液于涂片上,用木夾夾住載玻片一端,在微火(普通酒精燈)上加熱至染料冒蒸汽并開始計時。維持 5min。加熱過程中及時補充染液。切勿讓涂片干涸。 

3) 水洗 

待玻片冷卻后,用緩流自來水沖洗載玻片背面,直至流出的水無色為止。 

4) 復染

0.5%番紅染液復染 1.5min

5) 水洗

用緩流水洗后,干燥。 

6) 鏡檢(普通光學顯微鏡) 

先低倍鏡,再高倍鏡,最后油鏡觀察。

2.6、生理生化試驗 

1)配制培養(yǎng)基 

分別配制淀粉培養(yǎng)基、油脂培養(yǎng)基,配制好后放入三角瓶中準備滅菌。配制葡萄糖和乳糖發(fā)酵培養(yǎng)基,裝入試管,將其中的德漢氏小管灌滿放入試管。配制蛋白胨水培養(yǎng)基和葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基,配制好后加入試管中,每支試管 1/3 體積培養(yǎng)基,準備滅菌。

2)接種準備

將培養(yǎng)基貼上標簽包好后放到高壓蒸汽滅菌鍋中,在 121℃滅菌 20 分鐘。滅完菌取出后冷卻,將淀粉培養(yǎng)基、油脂培養(yǎng)基倒平板。

 3)接種

①在淀粉培養(yǎng)基、油脂培養(yǎng)基平板背面用標簽筆畫一個十字,將其分為相等的四個區(qū)域,再在相應的位置寫上要種的菌種的編號,在無菌條件下,將菌種分別接在相應的區(qū)域,對于淀粉培養(yǎng)基,在接種時,采取觸點接種,對于脂肪培養(yǎng)基,采取畫十字接種,貼上標簽。 

②在無菌條件下,將各菌種分別接在糖發(fā)酵培養(yǎng)基液中,每種菌在葡萄糖和乳糖培養(yǎng)基中各接兩支培養(yǎng)基,每種留一支作為對照,貼上標簽。

③在無菌條件下,將各菌分別接種在蛋白胨水培養(yǎng)基和葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基中,每種菌分別在蛋白胨水培養(yǎng)基和葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基中接兩支培養(yǎng)基試管,貼上標簽。

4)培養(yǎng) 

將接種好的培養(yǎng)基放到 37 攝氏度的恒溫箱中培養(yǎng) 48 小時。

5)實驗觀察

2.7、確定菌屬

在根據(jù)以上實驗結(jié)果的基礎上,查詢伯杰氏手冊,確定菌的屬。


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