AP融合蛋白的測(cè)定
 
A．酶裂解測(cè)定法
 
1．在離心管中加入恒定濃度(1—5ug)的AP融合蛋白以及相應(yīng)的能夠結(jié)合此融合蛋白的抗親和性結(jié)構(gòu)域標(biāo)簽樹(shù)脂。室溫反應(yīng)2小時(shí)，溫和搖動(dòng)。
2．5000g離心1分鐘，棄去上清。用1mlTE重懸并再次離心。以TE和蛋白酶反應(yīng)緩沖液分別洗滌樹(shù)脂一次。
3．以200ul蛋白酶反應(yīng)緩沖液重懸此洗滌過(guò)的樹(shù)脂。為達(dá)到一個(gè)適合的反應(yīng)速率所需的蛋白酶的量需要通過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行測(cè)定。對(duì)于一個(gè)預(yù)實(shí)驗(yàn)，陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照的底物融合蛋白應(yīng)該用一系列濃度的蛋白酶進(jìn)行處理。
4．在不同的時(shí)間間隔，從反應(yīng)體系上清中吸取20ul溶液轉(zhuǎn)移到一個(gè)干凈的離心管或微孔板中。合理地設(shè)置時(shí)間間隔，使之能夠監(jiān)測(cè)廣泛變化的反應(yīng)速率。例如，在反應(yīng)的*分鐘間隔2分鐘取樣，之后的20分鐘內(nèi)間隔5分鐘取樣，然后在接下來(lái)的60分鐘內(nèi)間隔15分鐘取樣。
5．將10ul AP樣品和90ul的AP底物溶液(根據(jù)商說(shuō)明書(shū)制備)加入到一個(gè)單獨(dú)的微孔板中。繪制純化AP已知濃度的一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)曲線。以合適的波長(zhǎng)對(duì)反應(yīng)進(jìn)行監(jiān)測(cè)，通常使用能夠讀取動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)的酶標(biāo)儀。
6．測(cè)定反應(yīng)的起始速率，通過(guò)與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較計(jì)算出樣品中釋放的AP濃度。繪制出隨時(shí)間變化而被酶切釋放出的AP。如果底物濃度比K，值小得多，那么起始反應(yīng)速率與底物連接序列酶切反應(yīng)的是kcat/Km值是成比例的。
 
B．底物連接序列的蛋白酶酶切位點(diǎn)的測(cè)定
 
1．進(jìn)行類(lèi)似實(shí)驗(yàn)方案7，2B中提供的酶切反應(yīng)，在一個(gè)較小的體積中(50ul)，使用更多  的AP融合蛋白(5～10ug)并捕獲更多的樹(shù)脂。加入足夠的蛋白酶，反應(yīng)足夠長(zhǎng)的時(shí)  間以消化底物連接序列，以酶切動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)作為參照。
2．SDS—PAGE以分離反應(yīng)混合物。對(duì)于某些蛋白酶，建議在上樣之前使用適合的試劑使  酶失活，  因?yàn)橄耦?lèi)似枯草桿菌蛋白酶的酶類(lèi)能夠在變性和加熱的過(guò)程中以非特異的方  式消化蛋白。
3．將蛋白從凝膠上電轉(zhuǎn)化至膜上，染色顯示切割后的AP產(chǎn)物，并用標(biāo)準(zhǔn)方法對(duì)其進(jìn)行  NH2端測(cè)序。