ELISA方法:小鼠腦組織提取步驟
自行割取小鼠腦組織
4℃預(yù)冷的PBS漂去組織血漬，濾紙吸干殘留的PBS；
稱重，加入裂解液勻漿（在冰上）；
將得到的勻漿液用液氮反復(fù)凍融3次；
室溫靜置30mins，4℃15000r/min離心1h，取上清，分裝，-80℃保存。
簡介：目的建立動物組織內(nèi)P53蛋白的免疫檢測分析方法,為P53生物藥物的代謝分布研究提供檢測手段。方法辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記抗P53蛋白單克隆抗體3P40,應(yīng)用標(biāo)記后的抗體及重組P53蛋白的檢測,建立競爭性ELISA檢測方法;應(yīng)用此方法建立血清樣品中P53蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線,測定腹腔注射P53后不同時間小鼠血清中P53濃度。結(jié)果利用親和層析純化的3P40,進行HRP標(biāo)記,ELISA檢測3P40HRP滴度可達(dá)1∶200 000;建立的競爭性ELISA方法可以檢測PBST中P53蛋白,靈敏度達(dá)30 ng/ml,日內(nèi)精密度較高,相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）小于5%,體現(xiàn)較好的重復(fù)性;分別應(yīng)用正常小鼠血清、PBST稀釋的重組P53蛋白樣品進行競爭性ELISA檢測,結(jié)果顯示小鼠血清成分對P53蛋白檢測有一定的影響;應(yīng)用血清制備P53蛋白的標(biāo)準(zhǔn)曲線,檢測了腹腔注射P53蛋白后不同時間點小鼠血清樣品中的P53蛋白濃度。結(jié)論進行了抗P53單克隆抗體3P40的HRP標(biāo)記,建立了競爭性ELISA方法,可用于P53蛋白藥物血藥濃度檢測。
樣本暫時不測時負(fù)80冷凍保存，一般可以放置6個月左右，負(fù)20可放3個月，（若被檢物質(zhì)見光易分解則需避光保存）制備好的勻漿液需當(dāng)天進行測定（提取液不是被檢物質(zhì)的zui適環(huán)境） 1 準(zhǔn)確稱取組織重量按重量（g）：體積（ml）=1：N的比例加N倍體積的生理鹽水（或PBS）（推薦N=9），冰水浴勻漿（機械式，手動等，超聲不太推薦），制備成一定濃度的勻漿液，離心（根據(jù)被檢物質(zhì)的具休要求，推薦3000轉(zhuǎn)/分左右），取上清待測2 由于勻漿（提?。┻^程中會產(chǎn)生的一定的系統(tǒng)誤差，需對其進行較正可根據(jù)測其上清液中蛋白濃度進行較正