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技術(shù)文章

原位聚合酶鏈式反應(yīng)與原位反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應(yīng)操作規(guī)程

點擊次數(shù):1526 發(fā)布時間:2017-8-2

原位聚合酶鏈式反應(yīng)(in situ PCR)和原位反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應(yīng)(in situ RT-PCR)操作規(guī)程 

(一)、儀器設(shè)備 
英國Thermo Hybaid原位PCR儀。 

(二)、操作流程 
1、原位PCR步驟 
1)預(yù)處理: 
(1)切片常規(guī)脫蠟; 
(2)0.2mol/L HCl處理10min; 
(3)5μg/ml蛋白酶k消化組織37℃10min; 
(4)Nase消化組織37℃ 30min; 
(5)梯度酒精脫水,室溫干燥。 
2)原位擴增: 
(1)切片滴加特異性序列引物30μLpcr擴增反應(yīng)液,覆蓋硅化蓋玻片,石蠟油封邊; 
(2)PCR熱循環(huán):94℃,1min;55℃,1min;72℃,1.5min,共25~30個循環(huán),72℃延伸10min; 
(3)氯洗去蓋玻片,4%多聚甲醛后固定10min,梯度酒精脫水,干燥。 
3) 原位雜交: 
(1)加地高辛標記探針的雜交液,98℃變性10min,-20℃退火5min,42℃雜交過夜。 
(2)雜交后用2×SSC洗滌10min,3次,1×SSC洗滌10min,3次; 
(3)緩沖液洗滌10min,3次; 
(4)加堿性磷酸酶標記的羊抗地高辛抗體復(fù)合物,37℃,2h; 
(5)緩沖液洗滌5min,3次; 
(6)NBT、BCIP暗處顯色,鏡下控制,終止顯色。 
(7)常規(guī)脫水:透明、封固。 
2、原位RT-PCR步驟 
1)預(yù)處理: 
(1)蛋白酶K(0.3mg/mL) 54℃消化20min,蒸餾水洗; 
(2)95℃加熱3min,滅活殘存的蛋白酶。 
2)原位擴增: 
(1)在有RNA酶抑制劑存在的條件下,用隨機六聚物進行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng); 
(2)用熱啟動法進行PCR擴增。標本加熱至75℃時加上反應(yīng)液,覆以蓋玻片,四周用指甲油密封。然后將溫度升至95℃,2min。再將熱循環(huán)儀設(shè)定為95℃,45s,55℃,1min和75℃,45s,共26次循環(huán); 
(3)擴增結(jié)束后,在80℃烤15min~30min。 
3)原位雜交: 
(1)雜交前標本95℃加熱3min; 
(2)加上雜交液,濕盒內(nèi)50℃過夜;雜交液組成:25%硫酸葡聚糖,2×SSC,50%甲酰胺,0.33mg/ml變性的鮭魚精子DNA, 每0.5mL雜交液內(nèi)含生物素標記探針1ng。 
(3)擴增的β-肌動蛋白和IL-6用DAKO檢測試劑盒K600(鏈霉卵白素,生物素標記的堿性磷酸酶和硝基四氮唑藍)檢測。陽性反應(yīng)呈紫色。

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