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細胞培養(yǎng)技術(shù)（概念、環(huán)境、設(shè)施條件及制備）
點擊次數(shù)：877 發(fā)布時間：2017-2-20
一、細胞培養(yǎng)基本概念
細胞培養(yǎng)是指從體內(nèi)組織取出細胞摹擬體內(nèi)出現(xiàn)環(huán)境，在無菌、適當溫度及酸堿度和一定營養(yǎng)條件下，使期生長繁殖，并維持其結(jié)構(gòu)和功能的一種培養(yǎng)技術(shù)。細胞培養(yǎng)的培養(yǎng)物為單個細胞或細胞群。在醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)研究中應(yīng)用zui廣泛的是外周血淋巴細胞、皮膚或纖維細胞和各種能在體外長期生長的細胞系。外周血淋巴細胞培養(yǎng)具有時間短、技術(shù)簡便、可重復(fù)取材等優(yōu)點，它在臨床染色體分析中使用zui廣泛。體外培養(yǎng)細胞株可在培養(yǎng)過程中發(fā)生自發(fā)的或在外界作用下的轉(zhuǎn)化，成為*細胞系，也可直接建成*細胞系，*細胞系能在體外無取制的傳代和生長。*細胞系通常具有非整倍體細胞和各個細胞的核型不*相同特征。但細胞克隆的細胞系其這一特征可以不明顯。
二、細胞培養(yǎng)的環(huán)境
細胞在體外培養(yǎng)中所需的條件與體內(nèi)細胞基本相同。
1、無污染環(huán)境
培養(yǎng)環(huán)境無毒和無菌是保證細胞生存的首要條件。當細胞放置于體外培養(yǎng)時，與體內(nèi)相比細胞丟失了對微生物和有毒物的防御能力，一旦被污染或自身代謝物質(zhì)積累等，可導(dǎo)致細胞死亡。因此在進行培養(yǎng)中，保持細胞生存環(huán)境無污染、代謝物及時清除等，是維持細胞生存的基本條件。
2、恒定的溫度
維持培養(yǎng)細胞旺盛生長，必須有恒定適宜的溫度。人體細胞培養(yǎng)的標準溫度為36.5℃±0.5℃，偏離這一溫度范圍，細胞的正常代謝會受到影響，甚至死亡。培養(yǎng)細胞對低溫的耐受力較對高溫強，溫度上升不超過39℃時，細胞代謝與溫度成正比；人體細胞在39-40℃1小時，即能受到一定損傷，但仍有可能恢復(fù)；在40-41℃1 小時，細胞會普遍受到損傷，僅小半數(shù)有可能恢復(fù)；41-42℃1 小時，細胞受到嚴重損傷，大部分細胞死亡，個別細胞仍有恢復(fù)可能；當溫度在43℃以上1 小時，細胞全部死亡。
3、氣體環(huán)境
氣體是人體細胞培養(yǎng)生存必需條件之一，所需氣體主要有氧氣和二氧化碳。氧氣參與三羧酸循環(huán)，產(chǎn)生供給細胞生長增殖的能量和合成細胞生長所需用的各種成分。開放培養(yǎng)時一般把細胞置于95%空氣加5%二氧化碳混合氣體環(huán)境中。二氧化碳既是細胞代謝產(chǎn)物，也是細胞生長繁殖所需成分，它在細胞培養(yǎng)中的主要作用在于維持培養(yǎng)基的PH 值。大多數(shù)細胞的適宜PH 為7.2-7.4，偏離這一范圍對細胞培養(yǎng)將產(chǎn)生有害的影響。但細胞耐酸性比耐堿性大一些，在偏酸環(huán)境中更利于細胞生長。有資料顯示，原代羊水細胞培養(yǎng)PH6.8 時zui適。
細胞培養(yǎng)液PH 濃度的調(diào)節(jié)zui常用的為加NaHCO3 的方法，因為NaHCO3 可供CO2，但二氧易于逸出，故zui適用于封閉培養(yǎng)，而羥乙基乙硫磺酸（HEPES）因其對細胞無毒性，也起緩沖作用，有防止PH 迅速變動的特性而用于開放細胞培養(yǎng)技術(shù)中，其zui大優(yōu)點是在開放式培養(yǎng)或細胞觀察時能維持較恒定的PH 值。
4、細胞培養(yǎng)基
培養(yǎng)是既是培養(yǎng)細胞中供給細胞營養(yǎng)和促使細胞生殖增殖的基礎(chǔ)物質(zhì)，也是培養(yǎng)細胞生長和繁殖的生存環(huán)境。培養(yǎng)基的種類很多，按其物質(zhì)狀態(tài)分為半固體培養(yǎng)基和液體培養(yǎng)基兩類；按其來源分為合成培養(yǎng)基和天然培養(yǎng)基。
（1）合成培養(yǎng)基：合成培養(yǎng)基是根據(jù)細胞所需物質(zhì)的種類和數(shù)量嚴格配制而成的。內(nèi)含碳水化合物、氨基酸、脂類、無機鹽、維生素、微量無素和細胞生長因子等。單獨使用細胞雖有生存但不能很好的生長增殖。
（2）天然培養(yǎng)基：使用zui普遍的天然培養(yǎng)基是血清，基本以小牛血清zui普遍。血清由于含有多種細胞生長因子、促貼附因子及其多活性物質(zhì)。與合志培養(yǎng)基合用，能使細胞碩利增殖生長。常見使用zui為5-20%。
2、常用設(shè)施及設(shè)備
（1）超凈工作臺：也稱凈化工作臺，分為側(cè)流式、直流式和外流式三大類。
（2）無菌操作間：一般由更衣間、緩部間和操作間三部分組成。操作間放置凈化工作臺及二氧化碳培養(yǎng)箱、離心機、倒置顯微鏡等。緩沖間可放置電冰箱、冷藏器及消毒好的無菌物品等。
（3）操作間：普通培養(yǎng)箱、離心機、水浴鍋、定時鐘、普通天平及日常分析處理物品。
（4）洗刷消毒間：烤箱、消毒鍋、蒸餾水處理器及酸缸等。
（5）分析間：顯微鏡、計算機及打印機等。
3、培養(yǎng)器皿
細胞培養(yǎng)以玻璃器皿為主，常準備zui需是使用zui的三倍。器皿應(yīng)選擇透明度好、無毒、中性硬度玻璃制品。常用的玻璃器皿有下面幾種。
（1）液體儲存瓶：用于儲存各種配制好的培養(yǎng)液、血清等液體，常以500ml、250ml、100ml 生理鹽水瓶或血漿瓶代替。
（2）培養(yǎng)瓶：根據(jù)培養(yǎng)細胞種類要求不同培養(yǎng)瓶的形態(tài)各異，用于細胞傳代培養(yǎng)的細胞要求瓶壁厚簿均勻，便于細胞貼壁生長和觀察，瓶口要大小一致，口徑一般不小于1cm，允許吸管伸入瓶內(nèi)任何部位，規(guī)格有200ml、100ml、50ml、25ml、10ml 等幾種。用于外周血培養(yǎng)的常用10ml 普通圓瓶。兩種培養(yǎng)瓶均要求選用玻璃制成。
（3）培養(yǎng)皿：用于開放式培養(yǎng)及其它用途。分直徑30mm、60mm、120mm 等幾種。
（4）吸管：常用的有長吸管和短吸管兩類，長吸管也稱刻度吸管。其改良后管上部有球型刻度稱改良吸管，刻度吸管用于移動液體。常用1ml 和10ml 兩種。短吸管也叫滴管，分彎頭和直頭兩種。
（5）離心管：離心管是細胞培養(yǎng)中使用zui廣泛的器皿，根據(jù)用途不同形態(tài)各樣，常用于細胞培養(yǎng)的離心管有大腹式尖底離心管和普通尖底離心管兩類。前者分別為50ml、30ml、15ml；后者則多為10ml 和5ml。
（6）其它：如三角燒瓶、燒杯、量筒、漏斗、注射器等。