一、抗體原理：
    ELISA是以免疫學(xué)反應(yīng)為基礎(chǔ)，將抗原、抗體的特異性反應(yīng)與酶對(duì)底物的催化作用相結(jié)合起來(lái)的一種敏感性很高的試驗(yàn)技術(shù)。由于抗原、抗體的反應(yīng)在一種固相載體——聚苯乙烯微量滴定板的孔中進(jìn)行，每加入一種試劑孵育后，可通過(guò)洗滌除去多余的游離反應(yīng)物，從而保證試驗(yàn)結(jié)果的特異性與穩(wěn)定性。在實(shí)際應(yīng)用中，通過(guò)不同的設(shè)計(jì)，具體的方法步驟可有多種。比較常用的是ELISA雙抗體夾心法及ELISA間接法。

    二、抗體的定義：
    指抗原與相應(yīng)抗體之間所發(fā)生的特異性結(jié)合反應(yīng)。這種反應(yīng)既可在機(jī)體內(nèi)進(jìn)行，也可以在機(jī)體外進(jìn)行?？乖贵w反應(yīng)的過(guò)程是經(jīng)過(guò)一系列的化學(xué)和物理變化，包括抗原抗體特異性結(jié)合和非特異性促凝聚兩個(gè)階段，以及由親水膠體轉(zhuǎn)為疏水膠體的變化。多見(jiàn)的是“三抗”陽(yáng)性：“抗-HBs+、抗-HBe、和抗- HBc+”，這說(shuō)明乙肝病毒感染結(jié)束，體內(nèi)病毒清除，提示這個(gè)人免疫功能十分正常，可以獻(xiàn)血，也可以應(yīng)用他的血價(jià)乙肝免疫球蛋門(mén)（HBIG），用于對(duì)乙肝的防治。二抗陽(yáng)性”即“抗-HBs+和抗-HBe+”或“抗-HBs+和抗-HBc+”

    三、種屬區(qū)別：
    （1）第yi抗體就是平常所說(shuō)的抗體，即能和抗原特異性結(jié)合。第二抗體是能和抗體結(jié)合的，即抗體的抗體。主要用于檢測(cè)抗體的存在。一抗是針對(duì)抗原的抗體，二抗是針對(duì)一抗的抗體。即抗體也可以充當(dāng)抗原刺激機(jī)體產(chǎn)生抗體。也就是說(shuō)，抗原進(jìn)入機(jī)體刺激機(jī)體免疫系統(tǒng)產(chǎn)生免疫應(yīng)答，由B細(xì)胞可以產(chǎn)生與相應(yīng)抗原發(fā)生特異性結(jié)合的特殊蛋白質(zhì)。一抗二抗都是一種可以特異結(jié)合別的物質(zhì)的基團(tuán)，而且一抗可以至少結(jié)合兩種其他基團(tuán)（底物和二抗）。

    （2）二抗：一般來(lái)說(shuō)，不同的種屬來(lái)源與二抗的質(zhì)量沒(méi)有必然的，來(lái)源于山羊的二抗與來(lái)源于驢的二抗在一般的實(shí)驗(yàn)里沒(méi)有太多的差別。然而在一些特殊的實(shí)驗(yàn)里， 如雙標(biāo)實(shí)驗(yàn)里，如果其中一個(gè)一抗是山羊來(lái)源的，一個(gè)是小鼠來(lái)源的，則相應(yīng)的二抗分別要抗山羊和抗小鼠的二抗，這時(shí)候，二抗就不能選擇山羊或者小鼠來(lái)源的。 可以特異結(jié)合底物，就是識(shí)別出我們想要檢測(cè)的東西。一抗和底物結(jié)合與否用肉眼是看不出來(lái)的。二抗：可以和一抗結(jié)合，并帶有可以被檢測(cè)出的標(biāo)記(如帶熒光、放射性、化學(xué)發(fā)光或顯色基團(tuán)），作用是檢測(cè)一抗。 如果一抗自己帶有可以被檢測(cè)出的標(biāo)記(如帶熒光、放射性、化學(xué)發(fā)光或顯色基團(tuán)），則不需要二抗。但這樣成本很高，因?yàn)橐环N一抗只識(shí)別一種底物。所以如今的設(shè)計(jì)一般是二抗帶上可檢測(cè)標(biāo)記，再來(lái)檢測(cè)一抗。而一抗識(shí)別底物。這樣，當(dāng)一抗結(jié)合到底物上，就可以通過(guò)二抗檢測(cè)出來(lái)。
   
    四、操作步驟：
    1. 包被：用0.05M PH9.6 碳酸鹽包被緩沖液將抗體稀釋至蛋白質(zhì)含量為1～10μg/ml。在每個(gè)聚苯乙烯板的反應(yīng)孔中加0.1ml，4℃過(guò)夜。次日，棄去孔內(nèi)溶液，用洗滌緩沖液洗3次，每次3分鐘。(簡(jiǎn)稱(chēng)洗滌，下同)。
    2. 5%脫脂乳（SMP）或者BSA 37℃（或者RT封閉）封閉1小時(shí)。棄去孔內(nèi)溶液，用洗滌緩沖液洗3次，每次3分鐘。
    3. 加樣：加一定稀釋的待檢樣品0.1ml于上述已包被之反應(yīng)孔中，置37℃孵育1小時(shí)。然后洗滌。(同時(shí)做空白孔，陰性對(duì)照孔及陽(yáng)性對(duì)照孔)。 
    4. 加酶標(biāo)抗體：于各反應(yīng)孔中，加入新鮮稀釋的酶標(biāo)抗體(經(jīng)滴定后的稀釋度)0.1ml。37℃孵育0.5～1小時(shí)，洗滌。 
    5. 加底物液顯色：于各反應(yīng)孔中加入臨時(shí)配制的TMB底物溶液0.1ml，37℃10～30分鐘。 
    6. 終止反應(yīng)：于各反應(yīng)孔中加入2M硫酸0.05ml。 
    7. 結(jié)果判定：可于白色背景上，直接用肉眼觀察結(jié)果：反應(yīng)孔內(nèi)顏色越深，陽(yáng)性程度越強(qiáng)，陰性反應(yīng)為無(wú)色或極淺，依據(jù)所呈顏色的深淺，以“+”、“-”號(hào)表示。也可測(cè)O·D值：在ELISA檢測(cè)儀上，于450nm(若以ABTS顯色，則410nm)處，以空白對(duì)照孔調(diào)零后測(cè)各孔O·D值，若大于規(guī)定的陰性對(duì)照OD值的2.1倍，即為陽(yáng)性。
 
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