HL70017.6 v.A

 

乙酰膽堿酯酶活性抑制劑篩選比色法檢測(cè)試劑盒產(chǎn)品說明書

 

主要用途

 

乙酰膽堿酯酶活性抑制劑篩選比色法檢測(cè)試劑是一種旨在通過乙酰膽堿酯酶反應(yīng)系統(tǒng)中，在抑制劑存在與否的情況下，所釋放出巰基膽堿，與Ellman試劑反應(yīng)后，產(chǎn)生黃色5-巰基-2-硝基苯甲酸產(chǎn)物，出現(xiàn)吸光峰值的變化，即采用比色法來評(píng)價(jià)樣品酶活抑制能力的而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)經(jīng)過精心研制、成功實(shí)驗(yàn)證明的。其適用于各種抑制劑篩選檢測(cè)。產(chǎn)品嚴(yán)格無菌，即到即用，操作簡(jiǎn)捷，性能穩(wěn)定。

 

技術(shù)背景

 

乙酰膽堿酯酶（Acetylcholinesterase；AchE；EC3.1.1.7），又稱為紅細(xì)胞膽堿酯酶（RBC cholinesterase），廣泛存在于真核生物，包括某些植物，尤其在腦組織、神經(jīng)肌肉連接處（neuromuscular junction）、中樞神經(jīng)系統(tǒng)的膽堿能突觸（cholinergic synapses）和紅細(xì)胞膜上高度表達(dá)，催化主要的神經(jīng)傳導(dǎo)介質(zhì)乙酰膽堿的水解反應(yīng)，產(chǎn)生乙酸和膽堿，終止突觸傳導(dǎo)。其功能在于調(diào)節(jié)乙酰膽堿作用。神經(jīng)毒氣，例如有機(jī)磷沙（Sarin），抑制乙酰膽堿酯酶活性，導(dǎo)致神經(jīng)肌肉癱瘓，終發(fā)生窒息（asphyxiation）。血清乙酰膽堿酯酶濃度顯著降低與有機(jī)磷殺蟲劑中毒有關(guān)，因此血液檢測(cè)是環(huán)境污染的重要指標(biāo)。基于人工合成底物碘化硫代乙酰膽堿（acetylthiocholine iodide），在抑制劑存在與否的情況下，通過乙酰膽堿酯酶的作用，水解產(chǎn)生乙酸和硫代膽堿（thiocholine），與Ellman試劑5，5-二硫基-雙（2-硝基苯甲酸）[5，5’-dithiobis-（2-nitrobenzoic acid）；DTNB]反應(yīng)后，產(chǎn)生黃色的5-巰基-2-硝基苯甲酸（5-thio-2-nitrobenzoic acid；TNB），通過其吸收峰值的變化（412nm波長(zhǎng)），來定量分析乙酰膽堿酯酶抑制劑的效應(yīng)。乙酰膽堿酯酶反應(yīng)系統(tǒng)為：

 

   

 

產(chǎn)品內(nèi)容

 

緩沖液（Reagent A）  毫升

反應(yīng)液（Reagent B）  毫升

底物液（Reagent C）       毫升

陰性液（Reagent D）    毫升

產(chǎn)品說明書   1份

 

保存方式

 

保存在－20℃冰箱里；反應(yīng)液（Reagent B）和底物液（Reagent C）避免光照；有效保證6月

 

 

用戶自備

 

乙酰膽堿酯酶：用于抑制劑篩選

1.5毫升離心管：用于樣品操作的容器

比色皿或酶標(biāo)板：用于比色的容器

分光光度儀或酶標(biāo)儀：用于比色分析

 

實(shí)驗(yàn)步驟

 

• 測(cè)定準(zhǔn)備

 

• 準(zhǔn)備好待測(cè)樣品，置于冰槽里備用
• 開啟并設(shè)定好分光光度儀（溫度為37℃）：波長(zhǎng)412nm，間隔5分鐘，讀數(shù)3次（共15分鐘），并置零
• 從－20℃冰箱里取出試劑，置于冰槽里融化；反應(yīng)液（Reagent B）和底物液（Reagent C）避免光照
• 緩沖液（Reagent A）室溫下均衡溫度

 

• 抑制劑篩選

 

• 在96孔酶標(biāo)板上做好相應(yīng)標(biāo)記：背景、*活性和待測(cè)抑制劑樣品
• 按下表加入試劑，進(jìn)行樣品預(yù)處理

 

內(nèi)容物	空背景對(duì)照	樣本背景	*酶活性	待測(cè)抑制劑酶活性
緩沖液（Reagent A）	xx微升	xx微升	xx微升	xx微升
陰性液（Reagent D）	xx微升	xx微升	xx微升	——
待測(cè)抑制劑	——	xx微升	――	xx微升
用戶自備的純化酶	——	——	xx微升（1毫單位）	xx微升（1毫單位）
96孔板每孔總量	空背景對(duì)照孔 （xx微升）	樣本背景孔 （xx微升）	*活性孔 （xx微升）	待測(cè)抑制劑樣品孔 （xx微升）
輕輕搖動(dòng)酶標(biāo)板，混勻，放進(jìn)37℃培養(yǎng)箱里孵育30分鐘。然后進(jìn)行下列操作

 

• 分別移取xx微升緩沖液（Reagent A）到新的96孔板的所有孔里
• 分別加入xx微升反應(yīng)液（Reagent B）
• 分別加入xx微升底物液（Reagent C） 
• 輕輕搖動(dòng)酶標(biāo)板
• 在37℃溫度下孵育3分鐘
• 加入20微升上述預(yù)處理的待測(cè)樣品
• 即刻放進(jìn)37℃酶標(biāo)儀檢測(cè)：測(cè)讀15分鐘
• （選擇步驟）*酶活計(jì)算：

 

 

• 抑制活性計(jì)算：

 

 

注意事項(xiàng)

 

• 本產(chǎn)品為20次操作
• 操作時(shí)，須戴手套
• 樣品須澄清，至關(guān)重要
• 加樣后3秒內(nèi)比色測(cè)定
• 測(cè)定值由低到高變化；測(cè)定可持續(xù)15分鐘
• 用戶根據(jù)實(shí)際需求，可以調(diào)整純酶的濃度 
• 如果待測(cè)樣品濃度過高或過低，可以調(diào)整樣品濃度
• 可以使用乙酰膽堿酯酶抑制劑（1,5-bis(4-allyldimethylammoniumphenyl)pentan-3-one dibromide； BW284c51；IC50=30納摩爾）作為抑制劑對(duì)照 
• 乙酰膽堿酯酶單位活性定義為：在37℃，pH 7.5條件下，每分鐘內(nèi)能夠生成1微摩爾硫代膽堿所需的酶量作為一個(gè)活性單位
• 本公司提供系列乙酰膽堿酯酶檢測(cè)試劑產(chǎn)品

 

質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

 

• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩(wěn)定
• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定檢測(cè)敏感