HL50162.3.3 v.A

 

細(xì)胞IKKβ激酶活性光度法定量檢測(cè)試劑盒產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)

 

主要用途

 

細(xì)胞IKKβ激酶活性光度法定量檢測(cè)試劑是一種旨在通過(guò)人工合成多肽底物，在IKKβ激酶敏感性抑制劑存在與否的情況下，受到IKKβ磷酸化后，進(jìn)而由丙酮酸激酶和乳酸脫氫酶連續(xù)循環(huán)法反應(yīng)系統(tǒng)，測(cè)定產(chǎn)生ADP過(guò)程中，伴隨的還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）的氧化反應(yīng)， 即采用光度法測(cè)定其氧化后峰值的變化，以分析細(xì)胞裂解樣品中IKKβ特異活性的而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)經(jīng)過(guò)精心研制、成功實(shí)驗(yàn)證明的。其適用于各種細(xì)胞裂解萃取液樣品（動(dòng)物、人體）、部分或*純化酶樣品中IKKβ激酶的定量檢測(cè)，以及抑制劑和激活劑的篩選。產(chǎn)品嚴(yán)格無(wú)菌，即到即用，操作簡(jiǎn)捷，性能穩(wěn)定，高度敏感。

 

技術(shù)背景

 

B細(xì)胞κ輕鏈多肽基因促動(dòng)子抑制劑激酶復(fù)合物（Inhibitor of kappa light polypeptide gene enhancer in B-cells，kinase complex；IκB kinase；IKK；EC 2.7.11.10），是NF-κB信號(hào)通路中的成員之一，由3個(gè)亞體構(gòu)成：IKKα，又稱為IKK1或CHUK（conserved helix-loop-helix ubiquitous kinase）；IKKβ，又稱為IKK2或IKBKB；IKKγ，又稱為NEMO或IKBKG。ITI1、GPRK2L、GPRK4，屬于絲氨酸/蘇氨酸激酶（serine/threonine protein kinase）家屬中鳥(niǎo)苷酸結(jié)合蛋白偶聯(lián)受體激酶（guanine nucleotide-binding protein-coupled receptor kinase；GRK）亞系成員之一。多基因GRK亞系由6個(gè)成員構(gòu)成，分成3類：包括GRK1（視網(wǎng)膜色素激酶家系；rhodopsin kinase）、GRK2/3（β腎上腺素能受體激酶；β-adrenergic receptor kinase）以及IKK/5/6（IKK激酶）。其中G蛋白偶聯(lián)受體激酶4至少有4種變異體：IKKα、β、γ、δ，在睪丸組織中高度表達(dá)。IKK使G蛋白偶聯(lián)受體，例如多巴胺等去敏化（desensitization）、以及精子授精等有關(guān)。其目標(biāo)蛋白為活化的G-蛋白偶聯(lián)受體蛋白，進(jìn)行磷酸化后，抑制其功能。其功能異常將導(dǎo)致遺傳性或獲得性高血壓等疾病。其磷酸化目標(biāo)序列為RRREEEEESAAA。基于底物RRREEEEESAAA，在IKKβ激酶敏感性抑制劑5-苯基-3-脲啶噻吩-2-甲酰胺（(5-phenyl-3-ureido)-thiophene-2-carboxamide）存在與否的情況下，受到IKKβ激酶的磷酸化，獲得產(chǎn)物磷酸化多肽，進(jìn)而通過(guò)丙酮酸激酶（pyruvate kinase；PK）和乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase；LDH）反應(yīng)系統(tǒng)中，還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（reduced nicotinamide adenine dinucleotide；NADH）轉(zhuǎn)化為氧化型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide；NAD），其吸光峰值的變化（340nm），來(lái)定量分析IKKβ的特異活性。其反應(yīng)方式為：

 

 

產(chǎn)品內(nèi)容

 

清理液（Reagent A）  毫升

裂解液（Reagent B）  毫升

緩沖液（Reagent C）  毫升

酶促液（Reagent D）  微升

反應(yīng)液（Reagent E）  微升

底物液（Reagent F）  微升

陰性液（Reagent G）  微升

專性液（Reagent H）  微升

產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)       1份

 

保存方式

 

保存清理液（Reagent A）在4℃冰箱里；其余的保存在－20℃冰箱里，嚴(yán)格避免光照和反復(fù)凍融；有效保證6月

 

用戶自備

 

IKKβ激酶：用于抑制劑篩選

1.5毫升離心管：用于樣品保存的容器

15毫升錐形離心管：用于樣品處理的容器

細(xì)胞刮脫棒：用于貼壁細(xì)胞脫離

（微型）臺(tái)式離心機(jī)：用于組織預(yù)處理

100微升1厘米光徑比色皿或96孔板：用于光度分析操作的容器

分光光度儀或酶標(biāo)儀：用于樣品光度分析

 

實(shí)驗(yàn)步驟

 

• 待測(cè)樣品準(zhǔn)備

 

• 準(zhǔn)備好75cm²細(xì)胞培養(yǎng)瓶或100mm細(xì)胞培養(yǎng)皿的待測(cè)培養(yǎng)細(xì)胞（1至5 X 10⁷細(xì)胞）
• 小心加入xx毫升清理液（Reagent A），覆蓋生長(zhǎng)表面
• 小心抽去清理液
• 使用細(xì)胞刮脫棒輕柔刮脫細(xì)胞（注意：避免使用胰酶消化）
• 加入xx毫升清理液（Reagent A），混勻細(xì)胞
• 移入到預(yù)冷的15毫升錐形離心管（注意：懸浮細(xì)胞從這一步驟開(kāi)始）
• 放進(jìn)4℃臺(tái)式離心機(jī)離心5分鐘，速度為300g
• 小心抽去上清液
• 加入xx微升裂解液（Reagent B），充分混勻
• 轉(zhuǎn)移到預(yù)冷的1.5毫升離心管
• 強(qiáng)力渦旋震蕩15秒
• 置于冰槽里孵育30分鐘
• 放進(jìn)4℃微型臺(tái)式離心機(jī)離心5分鐘，速度為16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）
• 小心移取500微升上清液到新的預(yù)冷的1.5毫升離心管
• 移取10微升進(jìn)行蛋白定量檢測(cè)（注意：建議使用 Bradford蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒－30030.1）
• 即刻放進(jìn)－70℃保存或置于冰槽里繼續(xù)后續(xù)操作

 

• 測(cè)定準(zhǔn)備

 

• 準(zhǔn)備好待測(cè)樣品（例如細(xì)胞裂解懸液等），置于冰槽里 
• 設(shè)定好分光光度儀（溫度為30℃）：波長(zhǎng)為340nm，間隔1分鐘，讀數(shù)6次（共5分鐘），并置零
• 緩沖液（Reagent C）室溫下均衡溫度

 

• 背景對(duì)照測(cè)定

 

• 移取xx微升緩沖液（Reagent C）到新的比色皿
• 加入xx微升酶促液（Reagent D）
• 加入xx微升反應(yīng)液（Reagent E）
• 加入xx微升底物液（Reagent F）
• 放進(jìn)30℃培養(yǎng)箱里靜置3分鐘
• 加入xx微升陰性液（Reagent G）
• 上下傾倒數(shù)次，混勻（限定在3秒之內(nèi)）
• 即刻放進(jìn)分光光度儀檢測(cè)，此為背景空對(duì)照：340波長(zhǎng)讀數(shù)0分鐘 －340波長(zhǎng)讀數(shù)5分鐘

 

• 樣品總活性測(cè)定

 

• 移取xx微升緩沖液（Reagent C）到新的比色皿
• 加入xx微升酶促液（Reagent D）
• 加入xx微升反應(yīng)液（Reagent E）
• 加入xx微升底物液（Reagent F）
• 放進(jìn)30℃培養(yǎng)箱里靜置3分鐘
• 加入5微升待測(cè)樣品（注意：50微克細(xì)胞裂解蛋白；樣品須溶解）
• 上下傾倒數(shù)次，混勻（限定在3秒之內(nèi)）
• 即刻放進(jìn)分光光度儀檢測(cè)，此為樣品總活性讀數(shù)：340波長(zhǎng)讀數(shù)0分鐘 －340波長(zhǎng)讀數(shù)5分鐘 

 

• 樣品非特異活性測(cè)定

 

檢測(cè)開(kāi)始前，移取xx微升緩沖液（Reagent C）到1.5毫升離心管，分別加入xx微升專性液（Reagent H）和待測(cè)樣品（注意：50微克細(xì)胞裂解蛋白），混勻后，放進(jìn)30℃培養(yǎng)箱里孵育30分鐘。然后繼續(xù)下列操作。

 

• 移取xx微升緩沖液（Reagent C）到新的比色皿
• 加入xx微升酶促液（Reagent D）
• 加入xx微升反應(yīng)液（Reagent E）
• 加入xx微升底物液（Reagent F） 
• 放進(jìn)30℃培養(yǎng)箱里靜置3分鐘
• 加入20微升上述預(yù)處理的待測(cè)樣品
• 上下傾倒數(shù)次，混勻（限定在3秒之內(nèi)）
• 即刻放進(jìn)分光光度儀檢測(cè)，此為樣品非特異活性讀數(shù)：340波長(zhǎng)讀數(shù)0分鐘 －340波長(zhǎng)讀數(shù)5分鐘

 

• 計(jì)算樣品活性

 

• 樣品總活性和非特異活性計(jì)算

 

 

2）樣品特異活性計(jì)算

 

 

七、酶標(biāo)儀測(cè)定

 

1）樣品總活性測(cè)定

• 在96孔板上做好相應(yīng)標(biāo)記：背景對(duì)照和樣品
• 分別移取xx微升緩沖液（Reagent C）到96孔板里
• 分別加入xx微升酶促液（Reagent D）
• 分別加入xx微升反應(yīng)液（Reagent E）
• 分別加入xx微升底物液（Reagent F）
• 輕輕搖動(dòng)96孔板
• 在30℃溫度下孵育3分鐘
• 分別加入xx微升陰性液（Reagent G）或待測(cè)樣品（50微克細(xì)胞裂解懸液蛋白）到相應(yīng)孔里（注意：樣品須清澈）
• 輕輕搖動(dòng)96孔板
• 即刻放進(jìn)酶標(biāo)儀檢測(cè)：0分鐘讀數(shù)和5分鐘讀數(shù)
• 活性計(jì)算：

 

 

• 樣品非特異活性測(cè)定

 

檢測(cè)開(kāi)始前，移取xx微升緩沖液（Reagent C）到1.5毫升離心管，分別加入xx微升專性液（Reagent H）和待測(cè)樣品（注意：50微克細(xì)胞裂解蛋白），混勻后，放進(jìn)30℃培養(yǎng)箱里孵育30分鐘。然后繼續(xù)下列操作。

• 在96孔板上做好相應(yīng)標(biāo)記：待測(cè)樣品
• 移取xx微升緩沖液（Reagent C）到96孔板里
• 加入xx微升酶促液（Reagent D）
• 加入xx微升反應(yīng)液（Reagent E）
• 加入xx微升底物液（Reagent F） 
• 輕輕搖動(dòng)96孔板
• 在30℃溫度下孵育3分鐘
• 加入20微升上述預(yù)處理的待測(cè)樣品
• 輕輕搖動(dòng)96孔板
• 即刻放進(jìn)酶標(biāo)儀檢測(cè)：0分鐘讀數(shù)和5分鐘讀數(shù)
• 活性計(jì)算：

 

 

• 樣品特異活性計(jì)算

 

 

八、抑制劑篩選

 

• 在96孔板上做好相應(yīng)標(biāo)記：背景、*活性和待測(cè)抑制劑樣品
• 按下表加入試劑，進(jìn)行樣品預(yù)處理

 

內(nèi)容物	空背景對(duì)照	樣本背景	*酶活性	待測(cè)抑制劑酶活性
緩沖液（Reagent C）	xx微升	xx微升	xx微升	xx微升
陰性液（Reagent G）	xx微升	xx微升	xx微升	——
待測(cè)抑制劑	——	xx微升	――	xx微升
用戶自備的純化酶	——	——	xx微升（1毫單位）	xx微升（1毫單位）
96孔板每孔總量	空背景對(duì)照孔 （xx微升）	樣本背景孔 （xx微升）	*活性孔 （xx微升）	待測(cè)抑制劑樣品孔 （xx微升）
輕輕搖動(dòng)96孔板，混勻，放進(jìn)30℃培養(yǎng)箱里孵育30分鐘。然后進(jìn)行下列操作

 

• 分別移取xx微升緩沖液（Reagent C）到新的96孔板的所有孔里
• 分別加入xx微升酶促液（Reagent D）
• 分別加入xx微升反應(yīng)液（Reagent E）
• 分別加入xx微升底物液（Reagent F） 
• 輕輕搖動(dòng)96孔板
• 在30℃溫度下孵育3分鐘
• 加入20微升上述預(yù)處理的待測(cè)樣品
• 即刻放進(jìn)30℃酶標(biāo)儀檢測(cè)：測(cè)讀30分鐘
• 抑制活性計(jì)算：

 

注意事項(xiàng)

 

• 本產(chǎn)品為25次操作，包括背景操作
• 操作時(shí)，須戴手套
• 系統(tǒng)操作過(guò)程中，背景測(cè)定只需1次
• 樣品處理忌用磷酸緩沖溶液
• 樣品須澄清，至關(guān)重要 
• 加入樣品啟動(dòng)反應(yīng)后3秒內(nèi)即刻光度測(cè)定
• 測(cè)定值由高到低變化；測(cè)定可持續(xù)30分鐘
• 光度測(cè)定后，比色皿須清洗*
• 樣本測(cè)定0分鐘讀數(shù)高于5分鐘讀數(shù)表明具有酶活性
• 建議待測(cè)樣本蛋白濃度為50微克/5微升（本公司提供  Bradford蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒－30030.1）
• 如果待測(cè)樣品濃度過(guò)高或過(guò)低，可以調(diào)整樣品濃度
• 可以使用IKKβ抑制劑作為抑制劑對(duì)照或陰性對(duì)照
• IKKβ活性單位濃度定義：在30℃溫度下，pH 7.5條件下，每分鐘內(nèi)能夠氧化1微摩爾還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）所需的酶量作為一個(gè)活性單位
• 本公司提供系列蛋白激酶檢測(cè)試劑產(chǎn)品

 

質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

 

• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩(wěn)定
• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定檢測(cè)敏感