真菌/酵母細(xì)胞線粒體內(nèi)膜功能/膜電位熒光測定試劑盒產(chǎn)品說明書

 

主要用途

 

真菌/酵母細(xì)胞線粒體內(nèi)膜功能/膜電位熒光測定試劑是一種旨在通過高度敏感的陽離子熒光羰花青染料結(jié)合到線粒體基質(zhì)，其熒光的增強(qiáng)或減弱說明線粒體膜電位的變化，即內(nèi)膜電負(fù)性的增高或降低，來分析線粒體內(nèi)膜功能的完整性的而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)經(jīng)過精心研制、成功實(shí)驗(yàn)證明的。其適用于各種實(shí)驗(yàn)用真菌/酵母菌株細(xì)胞線粒體內(nèi)膜功能/膜電位檢測。可以被用于細(xì)胞凋亡、信號傳遞、衰老等的研究。產(chǎn)品嚴(yán)格無菌，即到即用，活體檢測，操作簡易，性能穩(wěn)定。

 

技術(shù)背景

 

真菌/酵母細(xì)胞是一種低等單細(xì)胞真核生物，具有細(xì)胞生長快，易于培養(yǎng)，遺傳操作簡單明了等原核生物的特點(diǎn)。作為模式生物，它具有比較完備的基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制和表達(dá)產(chǎn)物的加工修飾能力，在分子遺傳學(xué)方面認(rèn)識早，先作為外源基因表達(dá)的細(xì)胞宿主。陽離子熒光羰花青染色劑JC-1（5,5',6,6'-tetrachloro- 1,1',3,3'-tetraethylbenzimidazolcarbocyanine iodide）是一種對膜電位高度敏感的染色劑。它特異性地進(jìn)入線粒體，分布和結(jié)合在線粒體基質(zhì)上。線粒體膜電位的高低變化決定了JC-1的分布濃度。電位高，JC-1形成聚集體，而濃度高，熒光顯色為紅色或桔紅色；反之，則為綠色。熒光減弱表明線粒體內(nèi)膜功能受到損害。 

 

產(chǎn)品內(nèi)容

 

清理液（Reagent A）                       80毫升

染色液（Reagent B）                      100微升

平衡液（Reagent C）                       20毫升

產(chǎn)品說明書               1份

 

保存方式

 

保存染色液（Reagent B）在－20℃冰箱里，嚴(yán)格避免光照；其余的保存在4℃冰箱里，有效保證6月

 

用戶自備

 

1.5毫升離心管：用于真菌/酵母染色的容器

載玻片：用于染色觀察

微型臺式離心機(jī)：用于樣品操作

培養(yǎng)箱或恒溫水槽：用于染色孵育

比色皿或96孔板：用于熒光定量分析的容器

（共聚焦）熒光顯微鏡：用于細(xì)胞熒光分析

細(xì)胞流式儀：用于細(xì)胞熒光分析

熒光分光光度儀或熒光酶標(biāo)儀：用于細(xì)胞熒光定量分析

 

 

 

實(shí)驗(yàn)步驟

 

實(shí)驗(yàn)開始前，將－20℃冰箱里的試劑盒中的染色液（Reagent B）置入冰槽里融化，平衡液（Reagent C）放進(jìn)28℃恒溫水槽里預(yù)熱。然后移出10微升染色液（Reagent B）到新的1.5毫升離心管，加入990微升平衡液（Reagent C），混勻后，在冰槽里靜置，并標(biāo)記為染色工作液，放在暗室里。然后進(jìn)行下列操作。

 

• 準(zhǔn)備好1毫升新鮮的酵母菌液（OD600＝1至2；1 X 10⁷細(xì)胞/毫升）
• 移入到1.5毫升離心管
• 放進(jìn)微型臺式離心機(jī)離心10分鐘，速度為1000g（或3000RPM，例如eppendorf 5415）
• 小心抽掉上清液
• 加入1毫升預(yù)冷的清理液（Reagent A），混勻
• 放進(jìn)微型臺式離心機(jī)離心10分鐘，速度為1000g（或3000RPM，例如eppendorf 5415）
• 小心抽掉上清液
• 重復(fù)實(shí)驗(yàn)步驟5至7一次
• 加入500微升含有染色液（Reagent B）和平衡液（Reagent C）的染色工作液，混勻（注意：參見注意事項(xiàng)7）
• 放進(jìn)28℃培養(yǎng)箱里或恒溫水槽孵育20分鐘，避免光照
• 放進(jìn)微型臺式離心機(jī)離心10分鐘，速度為1000g（或3000RPM，例如eppendorf 5415）
• 小心抽掉上清液
• 加入1毫升預(yù)冷的清理液（Reagent A），混勻
• 放進(jìn)微型臺式離心機(jī)離心10分鐘，速度為1000g（或3000RPM，例如eppendorf 5415）
• 小心抽掉上清液
• 加入500微升預(yù)冷的清理液（Reagent A），混勻
• 放進(jìn)冰槽里
• 選擇下列方式之一進(jìn)行操作：

 

選擇一、（共聚焦）熒光顯微鏡觀察 

 

• 混勻后，移出50微升在載玻片上
• 即刻進(jìn)行載玻片壓片，在熒光顯微鏡下進(jìn)行觀察（單濾波或雙濾波）：

觀察紅色熒光：濾波器激發(fā)波長490nm，散發(fā)波長590nm或羅丹明（rhodamine）濾波器激發(fā)波長540nm，

散發(fā)波長570nm或德州紅（Texas Red）濾波器激發(fā)波長590nm，散發(fā)波長610nm――可見

亮紅色熒光；如果強(qiáng)度顯著減弱，表明線粒體膜電位受到破壞

 

觀察綠色熒光：濾波器激發(fā)波長490nm，散發(fā)波長530nm或熒光素（Fluorescein）濾波器激發(fā)波長490nm，

散發(fā)波長520nm――如果綠色熒光強(qiáng)度顯著增強(qiáng)，表明線粒體膜電位受到破壞，未結(jié)合JC

－1染料在細(xì)胞漿里

 

 

 

 

 

 

 

 

 

選擇二、細(xì)胞流式儀分析

 

• 混勻后，即刻進(jìn)行細(xì)胞流式儀雙通道分析：觀察50000個細(xì)胞以上

 

 

激發(fā)波長	488nm	488nm
匹配熒光染料	異硫氰酸熒光素（FITC）	藻紅蛋白（phycoerythrin；PE）
熒光顏色	綠色	紅色
散發(fā)波長	530	575
流式儀通道	FL1	FL2
熒光增強(qiáng)	膜損傷	膜電位正常

 

選擇三、熒光分光光度儀或熒光酶標(biāo)儀測定

 

• 混勻后，移出100微升到黑色96孔板里或100微升比色杯里
• 即刻放進(jìn)熒光分光光度儀或熒光酶標(biāo)儀測定（單一測定或雙重測定）：

單一測定：激發(fā)波長490nm，散發(fā)波長590nm，獲得相對熒光單位（RFU）：RFU值高表明線粒體膜電位正常

 

雙重測定：激發(fā)波長490nm，散發(fā)波長590nm，獲得紅色熒光單位

激發(fā)波長490nm，散發(fā)波長530nm，獲得綠色熒光單位――紅色熒光單位除以綠色熒光單位終獲得熒光比值：比值高表明線粒體膜電位正常