真菌/酵母細(xì)胞葡萄糖-6-磷酸脫氫酶酶動(dòng)力光度法定量檢測(cè)試劑盒產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)

 

主要用途

 

真菌/酵母細(xì)胞葡萄糖-6-磷酸脫氫酶（G6PD）活性酶動(dòng)力光度法定量檢測(cè)試劑是一種旨在通過(guò)特異反應(yīng)系統(tǒng)中氧化型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADP）還原后峰值的增高，即采用光度法來(lái)測(cè)定真菌/酵母細(xì)胞裂解樣品中酶活性的而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)經(jīng)過(guò)精心研制、成功實(shí)驗(yàn)證明的。其適用于各種真菌/酵母細(xì)胞裂解懸液樣品葡萄糖-6-磷酸脫氫酶的總活性檢測(cè)。產(chǎn)品嚴(yán)格無(wú)菌，即到即用，操作簡(jiǎn)捷，性能穩(wěn)定。

 

技術(shù)背景

 

葡萄糖-6-磷酸脫氫酶（Glucose-6-phosphate dehydrogenase；G6PD；EC1.1.1.49）是一種細(xì)胞漿中的酶，參與磷酸戊糖代謝通路，通過(guò)維持還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）水平，提供細(xì)胞還原性能量，進(jìn)而保持谷胱甘肽水平，幫助細(xì)胞，例如紅細(xì)胞，防止氧化損傷。同時(shí)NADPH的產(chǎn)生，促進(jìn)組織細(xì)胞（例如肝臟、乳腺、脂肪組織、腎上腺等）生物合成脂肪酸、類異戊二烯等。在植物中，存在葡萄糖-6-磷酸脫氫酶的多種異構(gòu)體，位于細(xì)胞漿、質(zhì)體基質(zhì)（plastidic stroma）、和過(guò)氧化體。在酵母細(xì)胞中，葡萄糖-6-磷酸脫氫酶缺陷將干擾硫的還原性同化作用（reductive assimilation），增強(qiáng)對(duì)于過(guò)氧化氫的敏感等。基于葡萄糖-6-磷酸（D-glucose-6-phosphate）在葡萄糖-6-磷酸脫氫酶的作用下，轉(zhuǎn)化為6-磷酸葡萄糖酸內(nèi)脂（6-phosphoglucono-δ-lactone） 產(chǎn)物后，同時(shí)其輔酶因子氧化型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（oxidized nicotinamide adenine dinucleotide phosphate；β-NADP）轉(zhuǎn)化為還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（reduced nicotinamide adenine dinucleotide phosphate；β-NADPH），通過(guò)測(cè)定吸光值的變化（340nm 波長(zhǎng)），來(lái)定量分析葡萄糖-6-磷酸脫氫酶的總活性。葡萄糖-6-磷酸脫氫酶反應(yīng)系統(tǒng)為：

 

G6PD

D-glucose-6-phosphate  +  β-NADP^＋  →   6-phosphoglucono-δ-lactone  +  β-NADPH

                              

產(chǎn)品內(nèi)容

 

裂解液（Reagent A）    10毫升

強(qiáng)化液（Reagent B）   2克

緩沖液（Reagent C）  10毫升

反應(yīng)液（Reagent D）     1.25毫升

底色液（Reagent E）     1.25毫升

陰性液（Reagent F）     1毫升

產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)      1份

 

 

 

 

 

保存方式

 

保存裂解液（Reagent A）、緩沖液（Reagent C）、反應(yīng)液（Reagent D）和底色液（Reagent E）在－20℃冰箱里；其余的保存在4℃冰箱里；反應(yīng)液（Reagent D）和底色液（Reagent E）避免光照；有效保證6月

 

用戶自備

 

1.5毫升離心管：用于樣品制備和保存的容器

15毫升錐形離心管：用于樣品制備的容器

（微型）臺(tái)式離心機(jī)：用于樣品操作

200微升1厘米光徑比色皿或96孔板：用于光度的容器

分光光度儀或酶標(biāo)儀：用于光度分析

 

實(shí)驗(yàn)步驟

 

實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前，將－20℃冰箱里的試劑盒中的裂解液（Reagent A）置入冰槽里融化。然后進(jìn)行下列操作。

 

• 樣品準(zhǔn)備

 

• 準(zhǔn)備好10毫升待測(cè)的新鮮真菌/酵母細(xì)胞（OD600＝0.4至0.8，即1至2 X 10⁷細(xì)胞/毫升）
• 移入到預(yù)冷的15毫升錐形離心管
• 置于冰槽里5分鐘
• 放進(jìn)4℃臺(tái)式離心機(jī)離心5分鐘，速度為1000g
• 小心抽去上清液
• 加入250微升裂解液（Reagent A），充分混勻
• 轉(zhuǎn)移到預(yù)冷的1.5毫升離心管
• 加入100毫克強(qiáng)化液（Reagent B）
• 強(qiáng)力渦旋震蕩15秒
• 置于冰槽里1分鐘
• 重復(fù)實(shí)驗(yàn)步驟9至10五次
• 加入250微升裂解液（Reagent A），充分混勻
• 放進(jìn)4℃微型臺(tái)式離心機(jī)離心15分鐘，速度為16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）
• 小心移取500微升上清液到新的預(yù)冷的1.5毫升離心管
• 移取10微升進(jìn)行蛋白定量檢測(cè)（注意：建議使用 Bradford蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒－30030.1）
• 即刻放進(jìn)－70℃保存或置于冰槽里繼續(xù)后續(xù)操作

 

• 測(cè)定準(zhǔn)備

 

• 開(kāi)啟并設(shè)定好分光光度儀（溫度為25℃）：波長(zhǎng)340nm，間隔60秒，讀數(shù)6次（共5分鐘），并置零 
• 從－20℃冰箱里取出試劑，置于冰槽里融化；底色液（Reagent E）避免光照
• 緩沖液（Reagent C）在室溫下均衡溫度

• 背景對(duì)照測(cè)定

 

• 移取195微升緩沖液（Reagent C）到新的比色皿
• 加入25微升反應(yīng)液（Reagent D）
• 加入25微升底色液（Reagent E）
• 上下傾倒數(shù)次，混勻
• 在25℃溫度下孵育3分鐘
• （選擇步驟）取出比色皿
• 加入5微升陰性液（Reagent F）
• 上下傾倒數(shù)次，混勻（限定在3秒之內(nèi)）
• 即刻放進(jìn)分光光度儀檢測(cè)，此為背景空對(duì)照（5分鐘讀數(shù)－0分鐘讀數(shù)）

 

• 樣品測(cè)定

 

• 移取195微升緩沖液（Reagent C）到新的比色皿
• 加入25微升反應(yīng)液（Reagent D）
• 加入25微升底色液（Reagent E）
• 上下傾倒數(shù)次，混勻
• 在25℃溫度下孵育3分鐘
• 加入5微升待測(cè)樣品（20微克蛋白）（注意：樣品須清澈）
• 上下傾倒數(shù)次，混勻（限定在3秒之內(nèi)）
• 即刻放進(jìn)分光光度儀檢測(cè)，此為樣品讀數(shù)（5分鐘讀數(shù)－0分鐘讀數(shù)） 

 

五、計(jì)算樣品活性

 

[（樣品讀數(shù)－背景讀數(shù)）X 0.25（體系容量；毫升）X樣品稀釋倍數(shù)]÷[0.005（樣品容量；毫升）X 6.22（毫摩爾吸光系數(shù)）X 5（反應(yīng)時(shí)間；分鐘）]＝單位/毫升÷（樣品蛋白濃度）毫克/毫升＝單位/毫克

 

單位＝微摩爾葡萄糖-6-磷酸/分鐘

 

• 酶標(biāo)儀測(cè)定

 

• 在96孔板上做好相應(yīng)標(biāo)記：背景對(duì)照和樣品
• 分別移取195微升緩沖液（Reagent C）到96孔板里
• 分別加入25微升反應(yīng)液（Reagent D）
• 分別加入25微升底色液（Reagent E）
• 輕輕搖動(dòng)96孔板
• 在25℃溫度下孵育3分鐘
• 分別加入5微升陰性液（Reagent F）或待測(cè)樣品（20微克蛋白）到相應(yīng)孔里（注意：樣品須清澈）
• 輕輕搖動(dòng)96孔板
• 即刻放進(jìn)酶標(biāo)儀檢測(cè)：5分鐘讀數(shù)和0分鐘讀數(shù)
• 活性計(jì)算

 

[（樣品讀數(shù)－背景讀數(shù)）X樣品稀釋倍數(shù)X 0.25（體系容量；毫升）]÷[0.005（樣品容量；毫升）X 6.22（毫摩爾吸光系數(shù)）X 0.6（光徑距離；厘米）X 5（反應(yīng)時(shí)間；分鐘）]＝單位/毫升÷（樣品蛋白濃度）毫克/毫升＝單位/毫克 

 

單位＝微摩爾葡萄糖-6-磷酸/分鐘

 

注意事項(xiàng)

 

• 本產(chǎn)品為50次操作，包括背景對(duì)照
• 操作時(shí)，須戴手套
• 強(qiáng)化液（Reagent B）為固體狀，移取方法為：使用0.5毫升PCR管的蓋子內(nèi)圈盛滿；或秤重0.1克
• 系統(tǒng)操作過(guò)程中，背景測(cè)定只需1次
• 建議使用比色皿測(cè)定
• 樣品須澄清，至關(guān)重要 
• 加樣后3秒內(nèi)光度測(cè)定
• 測(cè)定值由低到高變化；測(cè)定可持續(xù)5分鐘
• 光度測(cè)定后，比色皿須清洗*
• 樣本測(cè)定5分鐘讀數(shù)高于0分鐘讀數(shù)表明具有酶活性
• 建議待測(cè)樣本蛋白濃度為20微克/5微升；如果樣本酶活性過(guò)低或過(guò)高，則可以增加或降低樣本量（本公司提供  Bradford蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒－30030.1）
• 如果待測(cè)樣品濃度過(guò)高或過(guò)低，可以調(diào)整樣品濃度
• 葡萄糖-6-磷酸脫氫酶單位活性定義為：在25℃，pH 7.4條件下，每分鐘內(nèi)能夠轉(zhuǎn)化1微摩爾葡萄糖糖-6-磷酸至6-磷酸葡萄糖酸內(nèi)脂所需的酶量作為一個(gè)活性單位
• 本公司提供系列醫(yī)學(xué)生化經(jīng)典分析試劑產(chǎn)品