主要用途

 

 細(xì)胞培養(yǎng)液氧化應(yīng)激活性氧（ROS）光澤精化學(xué)發(fā)光法定量檢測(cè)試劑是一種旨在通過使用自由基  探針光澤精， 捕獲細(xì)胞培養(yǎng)上清液中的活性氧族， 使發(fā)光物氧化降解并發(fā)光， 在化學(xué)發(fā)光儀（Luminometer） 的幫助下定量檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)液活性氧族（超氧自由基陰離子） 的生成和數(shù)量的而經(jīng)典的技術(shù)方法。該  技術(shù)由大師級(jí)科學(xué)家精心研制、成功實(shí)驗(yàn)證明的。適用于各種動(dòng)物和人體細(xì)胞培養(yǎng)液的活性氧族的檢測(cè)。 產(chǎn)  品嚴(yán)格無菌，即到即用，操作簡(jiǎn)易，性能穩(wěn)定，檢測(cè)敏感。

 

技術(shù)背景

 

超氧自由基陰離子（superoxide radical；O2-）、過氧化氫（hydrogen peroxide；H2O2）、羥自由基或氫氧基   （hydroxyl radical；OH-）、過氧化基（peroxyl radical；ROO-）、氫過氧自由基（hydroperoxyl；HOO）、烷   氧自由基（alcoxyl radical）、氮氧基（nitric Oxide；NO-）、過氧亞硝基陰離子（peroxynitrite anion；ONOO-） 次氯酸（hypochlorous acid；HOCl）、半醌自由基（semiquinone radical）、單線態(tài)氧氣（singlet oxygen）等   細(xì)胞內(nèi)活性氧族（Reactive Oxygen Species；ROS）的產(chǎn)生和增多，甚而導(dǎo)致諸如男性不育、冠心病、風(fēng)濕  性關(guān)節(jié)炎、腫瘤、退行性病變等各種病理狀況。光澤精（lucigenin），又稱硝酸雙-N- 甲基吖啶翁

（bis-N-methylacridinium nitrate），是一種帶正電荷的發(fā)光劑，單價(jià)還原后生成光澤精自由基，再與超氧自 由基陰離子反應(yīng)生成不穩(wěn)定的中間物光澤精二惡二酮， 由此分解成電激發(fā)狀態(tài)（N－甲基丫啶酮），通過釋 放光子，回復(fù)到基態(tài)。光澤精作為探針，可以特異性檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)超氧自由基陰離子，其發(fā)光強(qiáng)度與 超氧自由基陰離子水平成正相關(guān)。

 

產(chǎn)品內(nèi)容

 

 清理液（Reagent A）

 發(fā)光液（Reagent B）

產(chǎn)品說明書

 

保存方式

 

 

毫升

毫升

1 份

 

保存  發(fā)光液（Reagent B） 在－20℃冰箱里， 嚴(yán)格避免光照； 其余的保存在 4℃冰箱里， 有效保

證 6 月

 

用戶自備

 

15 毫升錐形離心管：用于樣品操作的容器

臺(tái)式離心機(jī)：用于去除樣品雜質(zhì)

測(cè)試管：用于發(fā)光檢測(cè)用的專用試管

化學(xué)發(fā)光儀：用于檢測(cè)化學(xué)發(fā)光

實(shí)驗(yàn)步驟

 

一、 樣品預(yù)處理

 

1 ． 準(zhǔn)備 1 瓶 25cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶的新鮮待測(cè)細(xì)胞

2 ． 小心移取細(xì)胞培養(yǎng)液到 15 毫升錐形離心管

3 ． 放進(jìn) 4℃臺(tái)式離心機(jī)離心 10 分鐘，速度為 300g

4 ． 小心移取上清液到新的 15 毫升錐形離心管

5 ． 根據(jù)上清液容量和細(xì)胞數(shù)，計(jì)算出（N） X 106細(xì)胞/毫升

6 ． 放進(jìn) 37℃培養(yǎng)箱里備用（1 小時(shí)內(nèi)）

 

二、 測(cè)讀

 

測(cè)讀開始前， 打開化學(xué)發(fā)光儀， 設(shè)定儀器內(nèi)溫度為 37℃預(yù)熱和整合測(cè)讀 10 秒或 15 分鐘； 然后關(guān)掉實(shí)驗(yàn)室 的燈光。將－20℃冰箱里的試劑置入冰槽里融化，嚴(yán)格置于暗室里。然后進(jìn)行下列操作。

 

1 ． 準(zhǔn)備好測(cè)試管，做好標(biāo)記：陰性對(duì)照、樣品本底和樣品活性

2 ． 移取 xx 微升  清理液（Reagent A）到陰性對(duì)照測(cè)試管

3 ． 移取 400 微升上述預(yù)處理的細(xì)胞培養(yǎng)液到樣品本底測(cè)試管

4 ． 移取 400 微升上述預(yù)處理的細(xì)胞培養(yǎng)液到樣品活性測(cè)試管

5 ． 分別加入 xx 微升  發(fā)光液（Reagent B）到上述測(cè)試管，除樣品本底測(cè)試管

6 ． 輕輕渦旋混勻

7． 即刻放進(jìn) 37℃化學(xué)發(fā)光儀里測(cè)讀

8． 整合測(cè)讀 10 秒，獲得相對(duì)發(fā)光單位（relative light unit；RLU）

9． 或者整合測(cè)讀 15 分鐘， 獲得光電子讀數(shù)： X 106 CPM（counted photon per minute）（注意： 可以使用液 體閃爍儀替代）

10．計(jì)算 ROS 水平：

 

（樣品活性－樣品本底）  ÷              細(xì)胞】＝X  106 CPM/毫升＝X  106 CPM/【（N）X 106   細(xì)胞】

 

注意事項(xiàng)

 

1 ． 本產(chǎn)品為 50 次操作

2 ． 如果測(cè)定體系變化，則試劑用量相應(yīng)變化

3 ． 操作時(shí)，須戴手套

4 ． 測(cè)試前，細(xì)胞培養(yǎng)液須新鮮收集， 1 小時(shí)內(nèi)為最佳

5 ． 樣品制備后即刻測(cè)讀，不宜過夜保存

6 ． 培養(yǎng)液上清須澄清

7 ． 必要時(shí)，例如活性氧族過低，可以濃縮樣品處理

8 ． 測(cè)讀的所有步驟均須在暗室里進(jìn)行

9 ． 如果是注射式化學(xué)發(fā)光儀，建議測(cè)試前后使用無離子水沖洗化學(xué)發(fā)光儀注射（injector）管道 10 ．本公司提供系列活性氧分析試劑產(chǎn)品

 

質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

 

1 ． 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩(wěn)定

2 ． 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定檢測(cè)敏感