什么是DNA甲基化

DNA甲基化（DNA methylation）是DNA化學(xué)修飾的一種形式，能夠在不改變DNA序列的前提下改變遺傳表現(xiàn)。DNA甲基化是指在DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶的作用下，在基因組CpG二核苷酸的胞嘧啶5'碳位共價(jià)鍵結(jié)合一個(gè)甲基基團(tuán)。DNA甲基化的結(jié)果，一般是使甲基化位點(diǎn)的下游基因表達(dá)量變少。

圖1：DNA甲基化原理圖

為什么研究DNA甲基化

DNA 甲基化是早發(fā)現(xiàn)的基因表觀修飾方式之一，可能存在于所有高等生物中。DNA甲基化在維持細(xì)胞正常功能、傳遞基因組印記、胚胎發(fā)育、腫瘤發(fā)生等方面發(fā)揮重要作用，比如DNA甲基化能關(guān)閉調(diào)控細(xì)胞生長(zhǎng)基因的功能，導(dǎo)致細(xì)胞壞死或過(guò)度增值；此外，DNA甲基化還能引起染色質(zhì)結(jié)構(gòu)、DNA構(gòu)象、DNA穩(wěn)定性及DNA與蛋白質(zhì)相互作用方式的改變，從而控制基因表達(dá)。目前DNA甲基化已成為表觀遺傳學(xué)和表觀基因組學(xué)的研究熱點(diǎn)。

圖2：DNA甲基化的應(yīng)用

DNA甲基化與高通量測(cè)序

甲基化機(jī)制的發(fā)現(xiàn)，使DNA甲基化的研究受到了廣泛關(guān)注，從醫(yī)學(xué)領(lǐng)域擴(kuò)展到動(dòng)植物研究領(lǐng)域，同時(shí)在研究方法上也取得了很大突破。目前用于DNA甲基化檢測(cè)的方法大致可分成兩類：全基因組甲基化分析和特異位點(diǎn)甲基化檢測(cè)。以上兩類方法都是通過(guò)高通量測(cè)序來(lái)完成的，它不僅能夠覆蓋所有甲基化位點(diǎn)，還可以配合靶向技術(shù)檢測(cè)低頻甲基化信號(hào)，使我們能夠從全基因組水平來(lái)分析5’甲基胞嘧啶及組蛋白修飾等事件，這就是所謂的“DNA甲基化測(cè)序”。

圖3：甲基化DNA測(cè)序圖

DNA甲基化建庫(kù)

經(jīng)過(guò)甲基化修飾的DNA序列是不會(huì)改變的，常規(guī)建庫(kù)的測(cè)序不能檢測(cè)到甲基化位點(diǎn)，因此需要在建庫(kù)過(guò)程中對(duì)發(fā)生甲基化的位點(diǎn)進(jìn)行標(biāo)記區(qū)分。目前全基因組重亞硫酸氫鹽測(cè)序(WGBS或BS-Seq，Whole Genome Bisulfate Sequencing)是甲基化測(cè)序的*準(zhǔn)則，市場(chǎng)上的甲基化建庫(kù)試劑盒也都是基于此原理研發(fā)出來(lái)的。

說(shuō)到DNA甲基化建庫(kù)，我們先來(lái)看一下常規(guī)的DNA建庫(kù)流程，詳情請(qǐng)參考——劃重點(diǎn)！NGS中DNA建庫(kù)方法全面解析

主要流程：DNA //片段化——末端修復(fù)——A尾添加——接頭連接——PCR擴(kuò)增

圖4：DNA文庫(kù)構(gòu)建

與常規(guī)DNA建庫(kù)相比，甲基化建庫(kù)主要是在原有步驟的基礎(chǔ)上增加一步重亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化，對(duì)應(yīng)原理如下：

重亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化

在弱酸性條件下，亞硫酸氫根會(huì)結(jié)合到?jīng)]有甲基化的C堿基的第6位，而甲基化了的C堿基不會(huì)和亞硫酸氫根發(fā)生反應(yīng)。之后，用堿處理，結(jié)合了亞硫酸氫根的非甲基化的C會(huì)發(fā)生脫氨基，脫亞硫酸根，被轉(zhuǎn)化成U堿基，甲基化的胞嘧啶保持不變，還是C。 

圖5：亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化原理圖

經(jīng)亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化過(guò)的DNA，再經(jīng)過(guò)PCR，PCR新合成出來(lái)的鏈，對(duì)應(yīng)U堿基的位置就會(huì)被替換成了“T”。在接下來(lái)的測(cè)序過(guò)程中，測(cè)到的也是T堿基。后，我們只需看一個(gè)位置是“C”，還是“T”，就可以區(qū)分該位點(diǎn)是否被甲基化 。

圖6：DNA甲基化測(cè)序?qū)?yīng)堿基

目前對(duì)應(yīng)的甲基化建庫(kù)方法主要分為以下兩類：

I：選擇甲基化處理過(guò)的特異性接頭，在文庫(kù)構(gòu)建好后用重亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化，然后上機(jī)測(cè)序

DNA //片段化——末端修復(fù)——A尾添加——特殊接頭連接——PCR擴(kuò)增——重亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化

II：DNA //片段化后直接用重亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化，然后按照正常的DNA 建庫(kù)操作。

DNA  //片段化——重亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化——末端修復(fù)——A尾添加——接頭連接——PCR擴(kuò)增

兩種方法都有各自對(duì)應(yīng)的優(yōu)缺點(diǎn)，主要如下：

溫馨提示：

1.設(shè)置內(nèi)參：在甲基化文庫(kù)建程當(dāng)中，亞硫酸氫鹽對(duì)未甲基化的C的轉(zhuǎn)化效率并不是100%，一般是在99%左右。為了對(duì)實(shí)驗(yàn)的轉(zhuǎn)化效率進(jìn)行質(zhì)量控制。建議在轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)當(dāng)中加入內(nèi)參對(duì)照品。一般情況下，實(shí)驗(yàn)當(dāng)中是加入1%的*沒(méi)有甲基化的λ DNA做內(nèi)參，主要是甲基化酶缺陷型的大腸桿菌，所生產(chǎn)出來(lái)的*沒(méi)有被甲基化的λ（噬菌體）DNA，或者pUC19（質(zhì)粒）DNA做內(nèi)參。

2.濃度測(cè)定：經(jīng)過(guò)重亞硫酸鹽處理后的基因組DNA，由于其中非甲基化的“C”會(huì)轉(zhuǎn)化為“U”，所以回收后的DNA會(huì)是一種“A”,“T”和“U”占大部分的核酸分子，而且當(dāng)初的堿基配對(duì)形式也不復(fù)存在，取而代之的是主要以單鏈形式和非特異性配對(duì)形式存在的特殊核酸形態(tài)，這種形態(tài)的核酸在OD260處的吸光值與RNA更為相似，所以純化后基因組DNA的OD260值為1時(shí)，則相當(dāng)于大約40 μg/ml的核酸濃度。另外，基于處理后核酸狀態(tài)的特殊性，其OD230測(cè)值會(huì)出現(xiàn)異?，F(xiàn)象，可能導(dǎo)致OD260/OD230比值不穩(wěn)定，這種情況不會(huì)影響后續(xù)的PCR反應(yīng)。

3．上機(jī)測(cè)序：為了彌補(bǔ)甲基化文庫(kù)的堿基不平衡性，一般情況下，在上機(jī)過(guò)程當(dāng)中，摻入大比例的基因組文庫(kù)，或者PhiX文庫(kù)，來(lái)補(bǔ)充比較多的C堿基，一般會(huì)摻30%的PhiX文庫(kù)、或者基因組文庫(kù)。