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文獻分享|基于轉座酶的RNA-seq快速建庫流程，助力COVID-19檢測新思路
文獻精讀
文獻題目：RNA sequencing by direct tagmentation of RNA/DNA hybrids
中文題目：直接作用于切割RNA/DNA雜合鏈的RNA測序方法
發(fā)表時間：2020.1.27
發(fā)表期刊：PNAS
影響因子：9.58
合作單位：北京大學、清華大學
關鍵詞：RNA-Seq、Tn5轉座酶、SHERRY、ScRNA、SMART-Seq
背景簡介
RNA測序（RNA-seq）在基因表達差異分析方面的應用來說頗為成熟，主要包括目標RNA富集及片段化、一鏈和二鏈cDNA合成、PCR擴增等幾個主要流程。其中二鏈cDNA的合成是獲得高質量文庫的關鍵，但二鏈cDNA的合成需要引入額外的DNA聚合酶，可能導致測序的偏好性增加。
近日，北京大學的黃巖誼和謝曉亮研究團隊聯(lián)合清華大學王建斌研究團隊在美國《國家科學院院刊》(PNAS)發(fā)表了一篇名為“RNA sequencing by direct tagmentation of RNA/DNA hybrids”，介紹了一種新的基于Tn5轉座酶的轉錄組測序快速建庫方法，不僅可以消除常規(guī)RNA-seq需要cDNA二鏈合成的繁瑣性而且極大的突破了Tn5僅在DNA上作用的限制，大大拓展了Tn5轉座酶的應用范圍，同時或將為牽動人心的新型冠狀病毒肺炎（COVID-19）檢測提供新思路。
文章方法及主要內容
1.樣本處理：
1）Tn5轉座酶和Tn5 D188E突變株的制備、純化。
2）HEK293T和HeLa細胞培養(yǎng)、總RNA提取和純化mRNA。
3）單細胞制備。
2.研究內容：
1）Tn5轉座酶通過作用于RNA/cDNA雜合鏈用于RNA-seq
Tn5、RNase H和 MMLV逆轉錄酶的結構比對和分子對接的結果表明Tn5能夠作用于RNA/DNA雜交雙鏈。隨后將Tn5應用在HEK293T提取的mRNA/cDNA雜合鏈上，并進一步PCR擴增，片段化的RNA/cDNA雜合鏈和擴增產物的大小分布顯示，擴增后的產物分布比片段化的產物長100-150 bp左右。因此Tn5可作用于RNA/DNA雜合雙鏈同時應用于RNA-Seq快速建庫方法。
圖1.Tn5轉座酶在RNA/DNA雜合鏈的作用
2）SHERRY應用于一步快速RNA-seq文庫制備
Tn5轉座酶作用于RNA/DNA雜合鏈的轉錄組測序快速建庫方法，作者起名為SHERRY（Sequencing HEteRo RNA-DNA-Hybrid），SHERRY法轉錄組快速建庫流程：不同種類的RNA經過oligo-dT引物的反轉錄后，Tn5轉座酶隨機結合在RNA/DNA雜合鏈上進行切割；在Tagmentation之后，轉座酶會在雜合鏈兩端加上adaptor接頭，隨后進行延伸反應得到完整的含接頭的雙鏈DNA，后在測序引物作用下進行之后的PCR文庫擴增。
圖2.SHERRY轉錄組測序技術路線
SHERRY法轉錄組快速建庫流程和常規(guī)RNA-seq法在10 ng和200 ng的起始RNA上進一步驗證，結果顯示起始量為10 ng的RNA，SHERRY法檢測結果更精確。在差異表達基因檢測能力方面，SHERRY法和常規(guī)RNA-seq法檢測差異基因數目和fold changes數較為一致。同時實驗發(fā)現scSHERRY法在單細胞轉錄組測序中表現為更高的測序質量和更低的偏好性。
圖3.SHERRY法在轉錄組測序的應用
文章亮點
亮點1：Tn5轉座酶識別RNA/DNA雜交雙鏈并一步完成片段化和加接頭反應，突破了在雙鏈DNA上應用的限制；
亮點2：基于SHERRY的RNA-seq整體包含三個流程：RNA逆轉錄、RNA/cDNA的片段化和PCR擴增，簡化了常規(guī)RNA-Seq建庫流程，總體耗時僅約4小時，手動操作時間少于30分鐘，同時可在一個管子中完成反應。實現RNA的快速建庫，也極大的保證了測序的真實性。
亮點3：測序成本方面，SHERRY法轉錄組建庫僅為常規(guī)RNA-seq法的五分之一，大大節(jié)省實驗成本。
總結
基于Tn5轉座酶直接作用于RNA/DNA雜合鏈的片段化原理開發(fā)了一種轉錄組測序快速建庫新方法-SHERRY，進一步拓展了Tn5轉座酶的新用途，不僅解決了常規(guī)RNA-seq過程繁瑣、耗時長和偏好性大的問題，同時成本方面也大大降低。因此，相較于傳統(tǒng)的RNA文庫制備方法，SHERRY法快速建庫有著更大的競爭力。當前常規(guī)RNA-seq在SARS-CoV-2的鑒定、分型、溯源、診斷等方面展現了重要作用，但仍基于傳統(tǒng)的病原微生物宏基因組測序方法，耗時長且過程繁瑣。而基于Tn5轉座酶的轉錄組測序快速建庫方法或將為COVID-19快速、精準檢測帶來新的曙光。
參考文獻：Lin Di, Yusi Fu, Yue Sun, Jie Li, Lu Liu, Jiacheng Yao, Guanbo Wang, Yalei Wu, Kaiqin Lao, Raymond W. Lee, Genhua Zheng, Jun Xu, View ORCID ProfileJuntaek Oh, View ORCID ProfileDong Wang, X. Sunney Xie, Yanyi Huang, and View ORCID ProfileJianbin Wang，RNA sequencing by direct tagmentation of RNA/DNA hybrids（2020）. PNAS,117(6):2886-2893.
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方案一產品：
試劑類別 | 產品名稱 | 規(guī)格 | 貨號 |
核糖體去除 | Hieff NGS® MaxUp rRNA Depletion Kit (Human/Mouse/Rat) | 8/24/96 T | 12253ES08/24/96 |
Hieff NGS® RNA Cleaner | 5/60/450 mL | 12602ES08/56/75 | |
華大平臺 RNA建庫 | Hieff NGS® Dual-Mode RNA Library Prep Kit for MGI® | 8/16/96 T | 13332ES08/16/96 |
Illumina平臺 RNA建庫 | Hieff NGS® Dual-Mode RNA Library Prep Kit for illumina® | 8/16/96 T | 12251ES08/16/96 |
方案二產品：
試劑類別 | 產品名稱 | 規(guī)格 | 貨號 |
逆轉錄酶 | Hifair® IV Reverse Transcriptase 第四代耐熱逆轉錄酶 | 10000/5*10000 U | 11112ES92/93 |
Tn5建庫試劑盒 | Hieff NGS® Fast Tagment DNA Library Prep Kit for Illumina® (for 1 ng) | 8/24/96 T | 12206ES08/24/96 |
Tn5接頭 | Hieff NGS® Tagment Index Kit for Illumina® (96 Index) | 96 T | 12610ES96 |
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