聯(lián)系電話
翌圣生物科技（上海）股份有限公司
初級(jí)會(huì)員·13年
- 聯(lián)系人：
- 曹女士
- 電話：
- 400-6111-883
- 手機(jī)：
- 售后：
- 4006-111-883
- 傳真：
- 86-21-34615995
- 地址：
- 上海市浦東新區(qū)天雄路166弄1號(hào)3樓
- 網(wǎng)址：
- www.yeasen.com
掃一掃訪問手機(jī)商鋪
干貨分享|熱啟動(dòng)酶耐熱機(jī)制全面解析
常規(guī)PCR技術(shù)因能夠快速擴(kuò)增任何已知的DNA///片段而被廣泛應(yīng)用于分子生物學(xué)的各個(gè)領(lǐng)域。但常規(guī)型PCR技術(shù)容易出現(xiàn)引物二聚體或錯(cuò)配引起的非特異性擴(kuò)增等現(xiàn)象，造成實(shí)驗(yàn)結(jié)果的不準(zhǔn)確性。熱啟動(dòng)型PCR能夠很好的解決上述問題，是常用的提高PCR特異性的方法。
熱啟動(dòng)酶介紹
熱啟動(dòng)酶（Hot start enzyme）主要利用酶的修飾物在常溫下抑制DNA聚合酶的活性，加熱至變性溫度時(shí)修飾物失活，釋放酶活，從而使PCR反應(yīng)得以正常進(jìn)行。目前市面上常用的DNA聚合酶熱啟動(dòng)修飾方法主要有化學(xué)修飾、配體修飾和抗體修飾等，不同的熱啟動(dòng)修飾方法原理上有所區(qū)別，各有優(yōu)劣勢(shì)。
化學(xué)法
DNA聚合酶的化學(xué)法修飾，一般采用化學(xué)小分子如酸酐等有機(jī)物與聚合酶上的側(cè)鏈氨基酸（賴氨酸）通過化學(xué)反應(yīng)相互作用，使酶低溫時(shí)失去酶活，溫度升高后，酸酐與氨基之間的化學(xué)鍵斷裂，酶活釋放，從而達(dá)到熱啟動(dòng)效果。化學(xué)修飾可有效封閉酶的活性，操作簡單，但酶活性釋放速度較慢，依賴溫度激活DNA聚合酶，能有效抑制非特異性產(chǎn)物，可在室溫下配置反應(yīng)體系，且對(duì)PCR反應(yīng)buffer要求較高。
圖1：化學(xué)法修飾熱啟動(dòng)酶原理圖
配體法
配體法修飾，主要借助核酸適配體封閉酶活。顧名思義，核酸適配體一般指一類具有特異性識(shí)別功能的單鏈核酸分子，可以是RNA也可以是DNA，長度一般為25～60個(gè)核苷酸。作為一種寡核甘酸序列的識(shí)別分子，作用的靶分子范圍廣泛，從無機(jī)金屬的小分子到生物領(lǐng)域的大分子。這些適配子可以形成特定的空間構(gòu)象，從而在表觀功能上與抗體類似。對(duì)蛋白質(zhì)或其他小分子物質(zhì)具有高度特異性、親和力。核酸適配體通過非共價(jià)鍵與DNA聚合酶結(jié)合，進(jìn)而抑制聚合酶在非許可溫度下的聚合反應(yīng)。一般核酸適配體的篩選所需周期較短，整個(gè)過程能夠依賴自動(dòng)化，簡便快捷。
圖2：配體法修飾熱啟動(dòng)酶原理圖
抗體法
抗體法熱啟動(dòng)酶一般考慮使用DNA聚合酶抗體封閉酶活性，使其在低溫時(shí)處于無活性狀態(tài)，在加熱至變性溫度時(shí)抗體變性，解除封閉從而釋放活性，可以大大避免錯(cuò)配或引物二聚體引起的非特異性擴(kuò)增。另一方面針對(duì)低豐度基因，封閉抗體在避免預(yù)變性前的DNA聚合酶和模板的非特異性結(jié)合的同時(shí)，增加了引物與微量的正確模板碰撞退火的效率，從而保證低豐度基因的有效檢出，大大提升反應(yīng)靈敏度和擴(kuò)增效率。
圖3：抗體法修飾熱啟動(dòng)酶原理圖
表1：熱啟動(dòng)酶常見修飾方法優(yōu)劣勢(shì)比較
酶活封閉類型 | 化學(xué)修飾 | 配體修飾 | 抗體修飾 |
原理 | 化學(xué)小分子和DNA聚合酶活性中心結(jié)合封閉酶活 | 核酸適配體通過非共價(jià)鍵作用與聚合酶結(jié)合封閉酶活 | DNA聚合酶抗體與聚合酶結(jié)合封閉酶活 |
酶活釋放條件 | 溫度：大于95 ℃ 時(shí)間：10-15 min | 溫度：大于60 ℃ 時(shí)間：1-5 min | 溫度：大于70 ℃ 時(shí)間：30 s-5 min |
優(yōu)點(diǎn) | 酶活性維持更加穩(wěn)定且無任何外源DNA污染，性價(jià)比較高。 | 不需要激活步驟，穩(wěn)定性高，減少樣品降解的可能性。 | 酶激活時(shí)間短，保證酶活，親和力強(qiáng)，靈敏度高。 |
缺點(diǎn) | 酶激活時(shí)間較長可能會(huì)影響酶的活性，導(dǎo)致PCR產(chǎn)物的產(chǎn)量降低。 | 核酸配體是一種可逆抑制劑，不如化學(xué)修飾法穩(wěn)定，特異不夠強(qiáng)。 | 抗體修飾是一種動(dòng)態(tài)平衡，抗體生產(chǎn)成本高，試劑配比優(yōu)化時(shí)間長。 |
以上簡單介紹了熱啟動(dòng)酶的常見類別和各種熱啟動(dòng)方法的優(yōu)劣勢(shì)，其中化學(xué)修飾物不能夠批量合成，而且需要較長的激活時(shí)間聚合酶才能釋放酶活。配體修飾DNA聚合酶只在20-25°C效果較好，到40°C時(shí)，聚合酶的活性就被釋放出來，特異性不好；而抗體法修飾熱啟動(dòng)酶對(duì)應(yīng)的封閉效果佳，酶活釋放速度快，從而大大降低PCR反應(yīng)時(shí)間，是目前IVD市場(chǎng)上應(yīng)用較多的一種熱啟動(dòng)酶改造方法。
熱啟動(dòng)酶應(yīng)用
熱啟動(dòng)酶在熱啟動(dòng)PCR的應(yīng)用方面較為廣泛，不僅有效防止非特異性PCR產(chǎn)物，而且在較難擴(kuò)增的PCR反應(yīng)如單拷貝基因的擴(kuò)增、多重PCR和超長片段的擴(kuò)增等應(yīng)用尤為突出，大大改觀了傳統(tǒng)PCR技術(shù)的局限性。在病原微生物檢測(cè)、遺傳病診斷和法醫(yī)鑒定等各個(gè)領(lǐng)域等實(shí)際應(yīng)用中頗為廣泛。在應(yīng)對(duì)爆發(fā)的新guan疫情方面，熱啟動(dòng)酶亦貢獻(xiàn)頗多。目前市面上應(yīng)用于SARS-Cov-2的一步法RT-qPCR檢測(cè)試劑的核心酶基本都是抗體法熱啟動(dòng)酶。
相關(guān)產(chǎn)品
類型 | 名稱 | 貨號(hào) | 規(guī)格 | 價(jià)格(元） | 優(yōu)惠價(jià)（元） |
抗體法熱啟動(dòng)酶 | Hieff Unicon® Hotstart J-Taq DNA polymerase | 13086ES60/76/90 | 100 U/500 U/ 5000 U | 詢價(jià) | |
Hieff Unicon® Hotstart D-Taq DNA Polymerase | 10715ES01/03/25/60 | 100µl/1mL/25mL/ 100mL | 1652/13252/127852/887652 | / | |
封閉抗體 | Hieff® anti-Taq DNA Polymerase Antibody Taq酶單克隆抗體 | 31301ES60/80/90/92/93/94 | 100 µg/1/5/10/100/1000 mg | 1153/3653/14653/26353/231753/1969552 | / |
Hieff® anti-exonuclease of Taq Antibody Taq酶5'→3'外切酶單克隆抗體 | 31302ES60/80/90/92/93/94 | 100 µg/1/5/10/100/1000 mg | 1153/3653/14653/26353/231753/1969552 | / | |
參考文獻(xiàn)
【1】Michael R. Green, Joseph Sambrook. Hot Start Polymerase Chain Reaction (PCR)[J]. 2018, 2018(5):pdb.prot095125.
【2】Kermekchiev, M. B . Cold-sensitive mutants of Taq DNA polymerase provide a hot start for PCR[J]. Nucleic Acids Research, 2003, 31(21):6139-6147.
【3】Chou Q , Russell M , Birch D E , et al. Prevention of pre-PCR mis-priming and primer dimerization improves low-copy-number amplifications[J]. Nucleic Acids Research, 1992, 20(7):1717-1723.
【4】劉峰濤,柴立輝,馬遠(yuǎn)方.DNA聚合酶適配子6-10提高定量PCR的特異性[J].臨床檢驗(yàn)雜志,2009,27(03):164-166.
