Qubit核酸濃度檢測(cè)，小翊送你資料匯總

（包含實(shí)驗(yàn)常見(jiàn)問(wèn)題解析）

背景簡(jiǎn)介：

目前，實(shí)驗(yàn)室大多采用分光光度計(jì)來(lái)對(duì)DNA和RNA進(jìn)行定量。雖然這種方法被廣泛采用，但并不意味著它的讀數(shù)是準(zhǔn)確而可靠的。因?yàn)?/span>紫外吸光度測(cè)量不具有選擇性，無(wú)法區(qū)分DNA、RNA或蛋白質(zhì)，同時(shí)一些游離核苷酸或多余的鹽離子也會(huì)影響檢測(cè)的數(shù)值。此外，紫外分光光度計(jì)的靈敏度不足，無(wú)法完成低濃度DNA和RNA的定量。

基于此，Life Technologies（賽默飛世爾旗下）推出了Qubit，我們一起來(lái)探索一下qubit的神奇之處。

Qubit熒光計(jì)

Qubit熒光計(jì)是新一代核酸和蛋白定量?jī)x，是Thermo研發(fā)生產(chǎn)的一種檢測(cè)核酸質(zhì)量和數(shù)量，并對(duì)RNA、ssDNA、dsDNA、蛋白質(zhì)等進(jìn)行定量的小型儀器，主要用于需要進(jìn)行高靈敏性、高特異性及高度測(cè)量的實(shí)驗(yàn)應(yīng)用。 目前主要是以qubit3.0和qubit4.0為主。

儀器原理

采用熒光染料檢測(cè)特定目標(biāo)分子的濃度，配套只有與DNA、RNA或蛋白質(zhì)結(jié)合后才發(fā)出熒光的特異性熒光染料。這些熒光染料只有與特異性的靶分子結(jié)合時(shí)才能發(fā)出熒光信號(hào)，采用專門的熒光檢測(cè)技術(shù)，檢測(cè)特定目標(biāo)分子的濃度，從而對(duì)DNA和RNA進(jìn)行定量。

實(shí)驗(yàn)操作

簡(jiǎn)單兩步

1. 配置標(biāo)準(zhǔn)品并測(cè)量，儀器自動(dòng)校正并生成標(biāo)準(zhǔn)曲線；

2. 配置檢測(cè)樣本，上機(jī)檢測(cè)

圖2. Qubit實(shí)驗(yàn)操作流程圖

特點(diǎn)

Qubit技術(shù)只檢測(cè)靶分子（而不是污染物）的濃度，比如：Qubit檢測(cè)雙鏈DNA濃度時(shí)，特異性檢測(cè)待測(cè)樣本中的的雙鏈DNA，對(duì)于樣本中存在的單鏈DNA或者RNA不檢測(cè)。

這種特異性可以獲得十分的結(jié)果，對(duì)于芯片分析（Microarray）和實(shí)時(shí)定量PCR（qPCR）而言，測(cè)定樣本中的DNA或RNA是必需的。同時(shí)在新一代測(cè)序（NGS）實(shí)驗(yàn)中，對(duì)我們后續(xù)的建庫(kù)過(guò)程也是很必要的。

常見(jiàn)問(wèn)題匯總

1.Qubit檢測(cè)能否指示核酸樣品中的樣品質(zhì)量？

不能，Qubit 檢測(cè)僅 樣品中DNA/RNA的量。 Qubit熒光計(jì)不能獲取吸光度讀數(shù)以提供A260 / A280比率或檢測(cè)核酸樣品中的蛋白質(zhì)。質(zhì)量情況可以使用NanoDrop儀器完成。

2. 產(chǎn)品成分只有兩個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線的時(shí)候需要對(duì)standard 2進(jìn)行稀釋嗎？

使用產(chǎn)品時(shí)可直接用兩個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品測(cè)定熒光值后做標(biāo)準(zhǔn)曲線，即兩點(diǎn)連成直線。

如果想稀釋多個(gè)梯度制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，也可以使用1×TE對(duì)standard 2 進(jìn)行梯度稀釋。

另如果擔(dān)心96孔板測(cè)試時(shí)候熒光相互干擾，可選擇黑色的底部透明板。

3.使用酶標(biāo)儀做Qubit檢測(cè)，Ex值480 nm，Em值520 nm，但是我用的儀器沒(méi)有這兩個(gè)波長(zhǎng)設(shè)置，其他的波長(zhǎng)測(cè)定可以嗎？準(zhǔn)確度和靈敏度與酶標(biāo)儀相比如何？

可以，picogreen的吸收峰如下圖，可知Ex在480nm處有大吸收峰，Em在520nm處有大吸收峰，而如果儀器波長(zhǎng)不在這兩個(gè)上面，也是可以測(cè)定的，只不過(guò)熒光值會(huì)低一點(diǎn)的。

Qubit定量分析的準(zhǔn)確度和靈敏度與酶標(biāo)儀的準(zhǔn)確度和靈敏度相同。 這是產(chǎn)品開發(fā)過(guò)程中的一項(xiàng)要求。

4. 為什么要做復(fù)孔？

Qubit是一個(gè)靈敏度比較高的濃度測(cè)定儀器，測(cè)量值與樣本的質(zhì)量和外界的溫度都有關(guān)系，增加復(fù)孔可以有效降低測(cè)量過(guò)程中帶來(lái)的誤差，保證數(shù)據(jù)的可準(zhǔn)確性。

5. 復(fù)孔對(duì)應(yīng)的數(shù)據(jù)不一致？

1）操作誤差；2）樣本質(zhì)量差，濃度低對(duì)應(yīng)的誤差較大；3）片段長(zhǎng)度不均一（Qubit里面的染料對(duì)于不同長(zhǎng)度的DNA結(jié)合能力有差別，重復(fù)對(duì)應(yīng)的時(shí)間不同，熒光值不同）

6. 環(huán)境溫度不同，測(cè)試的值會(huì)不同嗎？

會(huì)的，Qubit里面對(duì)應(yīng)的熒光染料在不同的溫度下對(duì)應(yīng)的熒光信號(hào)強(qiáng)弱會(huì)有偏差的，一般在低溫測(cè)出的值會(huì)偏大大，高溫測(cè)出的值偏?。ㄔ谠噭┖兄袠?biāo)準(zhǔn)品恢復(fù)室溫測(cè)試時(shí)，整體誤差范圍在10%左右，極限誤差在15%左右）

7.測(cè)試復(fù)孔的時(shí)候，連續(xù)測(cè)，不取出來(lái)，為什么值越來(lái)越小？

連續(xù)在激發(fā)光激發(fā)的情況下，熒光染料的半衰期會(huì)降低，此時(shí)對(duì)應(yīng)收集的熒光信號(hào)會(huì)降低，對(duì)應(yīng)的數(shù)據(jù)會(huì)偏低，建議讀取完數(shù)據(jù)之后，從儀器中取出，5min左右再去測(cè)量，基本不會(huì)有什么偏差

8. 如何檢測(cè)Qubit試劑的測(cè)試準(zhǔn)確性？

1）相對(duì)準(zhǔn)確，參考life對(duì)應(yīng)試劑測(cè)量，對(duì)比結(jié)果分析；

2）準(zhǔn)確，試劑盒中配套的標(biāo)準(zhǔn)品，經(jīng)過(guò)適當(dāng)稀釋之后，上機(jī)測(cè)試，對(duì)比結(jié)果分析

對(duì)應(yīng)產(chǎn)品

dsDNA HS Assay Kit for Qubit®

                                           ——5min準(zhǔn)確定量結(jié)果

dsDNA Assay Kit for Qubit®是Yeasen生物開發(fā)的專門用于Qubit®熒光儀或熒光酶標(biāo)儀的試劑盒，線性范圍0.2-100 ng，即使在存在ssDNA、RNA和單體核苷酸的條件下，也可以選擇性的檢測(cè)dsDNA，且耐受較高濃度的蛋白質(zhì)、鹽類、洗滌劑等污染物。

簡(jiǎn)便：無(wú)實(shí)驗(yàn)操作簡(jiǎn)單，5min之內(nèi)出結(jié)果；

靈敏： 0.2-100ng的樣本，都能準(zhǔn)確定量；

準(zhǔn)確：競(jìng)品同比誤差小，均控制在10%以內(nèi)批間差異小；

穩(wěn)定：不同生產(chǎn)批次之間無(wú)差異。

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