活體成像應用

                                      ——實用生物發(fā)光技術

背景介紹

活體成像指在活體狀態(tài)下在細胞核分子水平上應用影像學方法對生物過程和時間上的定性和定量分析的一門科學，技術主要包括生物發(fā)光（bioluminescence）與熒光（fluorescence）、同位素成像(Isotopes)、X光成像(X-ray)等。其中，生物發(fā)光是用熒光素酶（Luciferase）基因標記細胞或DNA，而熒光技術則采用熒光報告基團表達的熒光蛋白（GFP、EGFP、RFP、YFP）、熒光染料等進行標記，然后利用儀器進行檢測。同位素成像是利用放射性同位素作為示蹤劑，對研究對象進行標記, 并進行活體成像的一種微量分析方法，通過活體成像技術可以觀測活體動物體內(nèi)腫瘤的生長及轉移、感染性疾病發(fā)展過程、特定基因的表達等生物學過程，其中以生物發(fā)光應用較為實用。

圖1：腫瘤藥物注射后生物發(fā)光、熒光與X光疊加圖（圖源自 slidesplayer）

表：不同成像技術的比較

活體成像應用范圍

生物發(fā)光技術原理

活體生物發(fā)光技術是指在動物體內(nèi)利用報告基因（如熒光素酶基因）表達所產(chǎn)生的熒光素酶蛋白與底物熒光素在氧、Mg²⁺存在的條件下消耗ATP發(fā)生氧化反應，將部分化學能轉化為光能釋放，在體外利用敏感的CCD設備形成圖像。熒光素酶報告基因質(zhì)粒可以被插入多種基因的啟動子，成為某種基因的報告基因，通過檢測報告基因從而實現(xiàn)對目標基因的監(jiān)測。

                                         圖2：生物發(fā)光活體成像檢測原理

生物熒光其本質(zhì)為化學熒光，熒光素被熒光素酶氧化的過程中可以釋放波長廣泛的可見光光子，其波長范圍為460-630nm（平均波長為560nm）。在哺乳動物體內(nèi)，血紅蛋白是吸收可見光的主要成分，能吸收藍綠光波段中的大部分可見光；水和脂質(zhì)主要吸收紅外線，但其均對波長為590-800nm的紅光近紅外線吸收能力較差，因此波長超過600nm的紅光雖然有部分散射消耗但大部分可以穿透哺乳動物組織而被高靈敏CCD檢測到。

圖3：CCD檢測儀器及生物發(fā)光成像檢測結果（左圖源自生物谷）

生物發(fā)光成像應用

1.疾病研究

腫瘤學

熒光素酶基因插入到腫瘤細胞的染色質(zhì)的隨機位點，再將該腫瘤細胞轉入動物體內(nèi)可以建立各種腫瘤模型，用于實時觀察體內(nèi)腫瘤細胞的增殖、生長、轉移情況，夠讓研究人員在近無創(chuàng)條件下直接快速觀察研究。其特點是*的靈敏度使微小的腫瘤病灶（少到幾百個細胞）也可以被檢測的到，比傳統(tǒng)方法的檢測靈敏度大大提高，避免tu殺老鼠而造成的組間差異，節(jié)省動物成本。

2.藥物研究

（1）抗腫瘤藥物研究

通過給予腫瘤接種的小鼠不同劑量、不同給藥時間、不同給藥途徑，觀察并制定合適的劑型與服藥時間。用熒光素酶標記腫瘤細胞， 建立各種可視腫瘤模型，實時評價各種治療手段的治療效果，可以動態(tài)觀察腫瘤細胞治療后的變化、腫瘤細胞是否死亡、腫瘤體積是否變小，這是生物發(fā)光活體成像技術的重要的應用領域。

（2）藥物代謝相關研究

標記與藥物代謝有關的基因，研究不同藥物對該基因表達的影響，從而間接獲知相關藥物在體內(nèi)代謝的情況。在藥劑學研究方面，可通過把熒光素酶報告基因質(zhì)粒直接裝在載體中，觀察藥物載體的靶向臟器與體內(nèi)分布規(guī)律。在藥理學方面，可用熒光素酶基因標記目的基因，觀察藥物作用的通路。

3.細胞標記

免疫細胞研究：標記免疫細胞，觀察免疫細胞對腫瘤細胞的識別和殺死功能，評價免疫細胞的免疫特異性、增殖、遷移等功能。

干細胞研究：標記組成性表達的基因，在轉基因動物水平，標記干細胞，若將干細胞移植到另外動物體內(nèi)，可用活體生物發(fā)光成像技術示蹤干細胞在體內(nèi)的增殖、分化及遷移的過程。

細胞凋亡:用分子生物學方法在熒光酶的兩端連接上抑制發(fā)光的蛋白（如激素酶），但在其連接處加上caspase，細胞發(fā)生凋亡時，表達caspase，切開抑制熒光酶發(fā)光的蛋白，使熒光素酶開始發(fā)光，觀察細胞凋亡情況。

4.基因表達與基因功能的研究

將熒光素酶基因插入到目的基因啟動子的下游，并穩(wěn)定整合于實驗動物染色體中，形成轉基因動物模型。該方式可實現(xiàn)目的基因與熒光素酶的表達平行，從而可直接觀察目的基因的表達模式，包括數(shù)量、時間、部位及影響其表達和功能的因素。

5.蛋白質(zhì)相互作用

將分開時都不單獨發(fā)光的熒光酶的C端和N端分別連接在兩個不同的蛋白質(zhì)上，若是這兩個蛋白質(zhì)之間有相互作用，熒光酶的C端和N端就會被連接到一起，激活熒光素酶的轉錄表達，在有底物存在時出現(xiàn)生物發(fā)光。在活體條件下研究藥物對蛋白質(zhì)相互作用的影響，可以觀察到在體外實驗中無法模擬的活體環(huán)境對蛋白質(zhì)相互作用的影響。

6.其他

生物發(fā)光的其他應用如RNAi、蛋白質(zhì)核運輸?shù)?。在熒光素酶基因的一端接要研究的蛋白質(zhì)的基因，另一端接肯定在細胞核內(nèi)表達的蛋白的基因，當核外的蛋白運輸?shù)胶藘?nèi)時，就會導致熒光素酶N端、C端靠近，恢復發(fā)光。

生物成像的影響因素

一、CCD的性能

二、實驗所采用的細胞和基因的表達情況

三、熒光標記物的選擇

四、熒光素酶成像時，底物濃度和溫度的影響

五、自發(fā)熒光的干擾 

技術應用前景

活體成像技術能夠將分子生物學技術從體外研究轉移到動物體內(nèi)研究。因此，該技術能夠觀測活體動物內(nèi)的基因表達和細胞活動，并且該技術具有檢測靈敏度高，操作簡單等優(yōu)勢，正在越來越廣泛地應用于醫(yī)學及生物學研究領域。可以概括為三點：第—，活體成像技術可將基因表達、生物信號傳遞等復雜的過程變成直觀的圖像，使人們能更好地在分子細胞水平上了解疾病的發(fā)生機制及特征；第二，能夠發(fā)現(xiàn)疾病早期的分子細胞變異及病理改變過程；后，可在活體上連續(xù)觀察藥物或基因治療的機理和效果。活體成像技術作為一種在體探測方法，其優(yōu)勢在于可以連續(xù)、快速、遠距離、無損傷地獲得人體分子細胞的三維圖像。它可以揭示病變的早期分子生物學特征，推動了疾病的早期診斷和治療，也為臨床診斷引入了新的概念。

FAQ

Q1：熒光素鉀鹽、鈉鹽、自由酸區(qū)別？

A：螢火蟲熒光素酶的底物有三種，熒光素自由酸及熒光素的鹽形式，包括鉀鹽和鈉鹽。三者的區(qū)別主要在于：

溶解性：鹽形式易溶于水，鉀鹽溶解度為60mg/ml，鈉鹽溶解度為100mg/ml。自由酸不易溶于水，可用碳酸氫鈉溶液弱堿調(diào)和

毒性方面：鹽形式在使用過程中較方便，尤其是在體內(nèi)成像實驗中，因其能夠溶解在水中，反應毒性也會更小些。

使用效果：無明顯差異。在體內(nèi)實驗研究中，選用鉀鹽使用率較高。

Q2：如何能檢測到體內(nèi)發(fā)出的可見光？

A：兩個主要的原因能夠保證可見光成像技術能夠檢測到體內(nèi)發(fā)出的微弱的可見光。a：高靈敏度的制冷CCD鏡頭，可達到零下-105℃，體內(nèi)發(fā)出的非常少的光子也能檢測得到。b：密封的暗箱裝置，可以屏蔽包括射線在內(nèi)的所有光線。

Q3：CCD鏡頭的低溫會不會對小動物產(chǎn)生影響？

A：不會的，低溫的范圍只局限于CCD鏡頭的小范圍內(nèi)，其他范圍內(nèi)都是室溫。

Q4：用熒光素進行活體成像與綠色熒光蛋白檢測體內(nèi)發(fā)光相比優(yōu)勢何在？

A：熒光素酶的偏紅光比綠色熒光蛋白的綠光在體內(nèi)的穿透性要強近100倍。熒光素是靠和熒光素酶的相互作用發(fā)光，特異性很強，得到的信噪比較高；熒光蛋白需要激發(fā)光來產(chǎn)生反射光，但是在檢測的過程中，老鼠的皮毛，皮膚都會產(chǎn)生非特異性熒光，使得信噪比降低。熒光蛋白檢測更適合于體外檢測，熒光素酶的檢測更適合于體內(nèi)檢測。

Q5：與傳統(tǒng)技術相比，生物發(fā)光成像技術優(yōu)勢體現(xiàn)在哪些方面？

A：與傳統(tǒng)技術相比，該技術對于腫瘤轉移的研究、基因治療、流行病學的發(fā)病學研究，干細胞示蹤，白血病的相關研究等方面，用該技術進行腫瘤的藥效研究，比傳統(tǒng)方法更靈敏，還可以通過一系列轉基因動物疾病模型，來快速直觀的進行相關疾病的發(fā)病機理和藥物篩選研究。

Q6：如何用熒光素酶基因標記干細胞嗎？

A：可標記組成性表達的基因，做成轉基因小鼠，干細胞就被標記了，從該小鼠的骨髓取出造血干細胞，移植到另外一只小鼠的骨髓內(nèi)，可以用該技術示蹤造血干細胞在體內(nèi)的增殖和分化及遷徙到全身的過程。另外一種方法是用慢病毒標記神經(jīng)干細胞。

產(chǎn)品信息

                                                                                                        HB20191126