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PCR-Free建庫，你get到了嗎？
高通量測序中，常規(guī)的文庫構(gòu)建需要PCR擴增，一方面，是為了對微量DNA樣本進行擴增，提高文庫產(chǎn)量，另一方面，可以放大熒光信號，讓測序儀更容易捕獲和識別熒光信號，提高測序準確度。但是，PCR就像一把“劍"，在解決了樣本起始量低的問題并起到放大熒光信號作用的同時，卻也引入了擴增錯誤和偏向性，不能地呈現(xiàn)基因組序列“真實面貌"。因此，PCR-Free技術(shù)的引入，既具備了PCR的優(yōu)勢，也克服了PCR的缺點。
什么是PCR-Free技術(shù)？
常規(guī)NGS文庫構(gòu)建的核心步驟為：基因組打斷-末端修復(fù)-加接頭-PCR-測序前信號放大。那么，PCR-Free建庫又是怎樣的呢？顧名思義，就是不需要PCR的建庫過程。其文庫構(gòu)建的核心步驟為：基因組打斷-末端修飾-加接頭-文庫質(zhì)控。但事實上，這只能算是建庫環(huán)節(jié)的PCR-Free。真正的PCR-Free，應(yīng)該是從建庫到測序全流程均無文庫擴增的過程（例如單分子測序技術(shù)）或者無PCR擴增錯誤累積的測序技術(shù)（例如MGI的DNBseq）。
圖1：常規(guī)建庫與PCR-Free建庫流程圖
PCR-Free技術(shù)優(yōu)勢
在常規(guī)建庫過程中，擴增酶存在引入錯誤的可能，通過循環(huán)擴增, 這些錯誤會被積累放大，降低了DNA序列復(fù)制的保真性。此外，DNA聚合酶還具有一定的擴增偏向性，尤其是針對GC含量差異大或者二級結(jié)構(gòu)等區(qū)域，擴增效率低，覆蓋均一性差；在引入錯誤InDel的同時，還會帶來大量的Duplication，造成DNA數(shù)據(jù)量的浪費，增加測序成本。而PCR-Free技術(shù)則能很好地規(guī)避常規(guī)建庫中因PCR擴增而引入的上述問題，具體優(yōu)勢如下圖所示。
圖2：PCR-Free技術(shù)優(yōu)勢
PCR-Free數(shù)據(jù)展示
1.華大平臺Hieff NGS® OnePot II DNA Library Prep Kit （Cat#13321）PCR-free建庫，相同投入量，不同的打斷時間，均能獲得良好的純化回收率和環(huán)化效率。具體數(shù)據(jù)如下表：
表1：MGI平臺PCR-Free建庫數(shù)據(jù)
建庫方法 | 打斷酶 | 打斷時間（min） | gDNA投入量 （ng） | 純化回收率 | ERA投入量 （ng） | ssCir總量 （ng） | 環(huán)化效率 |
PCR-free建庫 | Yeasen | 7 | 200 | 46.50% | 93 | 20 | 21.51% |
8 | 200 | 42.50% | 85 | 15 | 17.65% | ||
9 | 200 | 44.00% | 88 | 18 | 20.45% | ||
9 | 200 | 41.75% | 83.5 | 21.5 | 25.75% |
2.Illumina平臺Hieff NGS® OnePotTM II DNA Library Prep Kit（Cat#12204）與En*建庫試劑盒進行PCR-Free建庫實驗。上機測序數(shù)據(jù)結(jié)果顯示：12204測序數(shù)據(jù)更佳。
表2：Illumina平臺PCR-Free測序數(shù)據(jù)
建庫方法 | 試劑盒 | 酶切時間（min） | gDNA投入量（ng） | 接頭連接產(chǎn)物（ng） | 雙輪分選產(chǎn)物（ng） |
PCR-Free建庫 | 12204 | 12 | 500 | 380 | 76 |
En* | 15 | 500 | 420 | 81 |
clean_base (G) | clean_q20 (%) | clean_q30 (%) | clean/raw (%) | map_ratio (%) | Adapter (%) | Dup (%) | GC (%) | Depth | Coverage (%) |
42.5196 | 98.597 | 95.505 | 95.38 | 99.54 | 4.73 | 7.3646 | 41.218 | 14.77 | 99.3671 |
17.0161 | 98.497 | 95.279 | 93.34 | 99.57 | 3.67 | 5.4718 | 41.203 | 5.89 | 97.4356 |
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