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這才是CRISPR基因編輯實驗成功的關鍵點！
導 讀
2021年8月5日，美國加州大學伯克利分校的Jennifer Doudna團隊在Nature Chemical Bilology發(fā)文稱開發(fā)了一種基于CRISPR的核酸檢測新技術來檢測xin guan，最快20min完成檢測，較于傳統(tǒng)的RT-qPCR檢測方法更快速，這是CRISPR在病毒檢測領域應用的又一大進步。
CRISPR(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)即成簇規(guī)律間隔的短回文重復序列，它與Cas(CRISPR associated)蛋白組成的系統(tǒng)作為新一代的基因編輯工具，在基因敲入、基因敲除、基因激活、基因沉默、表觀遺傳修飾及3D基因結構改變中得到廣泛的應用[1]。
▲ 基因剪刀CRISPR（圖片來源網(wǎng)絡）
CRISPR/Cas的應用
? 藥物靶點的確定與驗證
? 基因環(huán)路上下游調控機制分析
? 代謝通路調節(jié)機制分析
? LncRNA作用機制分析
? 核酸檢測
CRISPR/Cas9系統(tǒng)
CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)是包含單鏈RNA的sgRNA，利用與sgRNA的5'端互補的序列將Cas9蛋白引導至目標DNA位點。Cas9 Nuclease對目標DNA序列的PAM依賴性識別并在PAM區(qū)上游3bp的特定位點啟動DNA切割。
Cas9 Nuclease生成的雙鏈斷裂可通過NHEJ（Non-homologous end joining）或HDR（Homology directed repair）修復，NHEJ修復通常導致indel突變和基因失活，而HDR可以在提供供體模板時實現(xiàn)高保真的精確基因組編輯。由于生物體具有自我修復機制，隨著細胞復制分裂并修復切口，在修復的過程可能產(chǎn)生錯配，移碼突變、缺失突變，最后篩選出錯配純合子。
圖2：An overview of CRISPR/Cas9 mediated genome editing[2]
CRISPR/Cas9系統(tǒng)成功的關鍵
? 如何減少和避免脫靶：
采用nick形式的Cas9 Nuclease加雙鏈sgRNA。
? sgRNA靶點的選擇：
Cas9 Nuclease切割位置在待修飾位點的30bp以內，Z差保持在50bp以內。
? sgRNA品質：
sgRNA活性是影響KI的關鍵因素之一，因此需要提前驗證其活性。
? Cas9 Nuclease形式的選擇：
縮短Cas9蛋白在細胞內的存續(xù)時間，可以避免連續(xù)切割和脫靶，建議使用mRNA或蛋白形式的Cas9。若采用質粒，需要確保其純度和濃度（建議大于1μg/μl）。
翌圣生物科技（上海）股份有限公司（以下簡稱“翌圣生物"）經(jīng)過匠心研發(fā)，開發(fā)出的sgRNA體外合成試劑盒利用其提供的試劑和使用者自己設計的特異性DNA序列，可在單管反應4小時內獲得20-100μg具有功能的高品質的sgRNA，具有合成效率高、品質好、切除效率高等特點。
Hifair® Precision sgRNA Synthesis Kit 測試數(shù)據(jù)
較高濃度的sgRNA關系到CRISPR/Cas9系統(tǒng)的編輯的效果成敗，因此只有加入高濃度的sgRNA方能對基因的編輯起較好效果。翌圣生物開發(fā)出的sgRNA體外合成試劑盒利用其提供的試劑和使用者自己設計的特異性DNA序列，可在單管反應4小時內獲得20-100μg，*基因編輯的需要。
圖3：不同時間的sgRNA的合成量
對于sgRNA Synthesis Kit不僅要滿足產(chǎn)量上的要求，還需要針對不同種類的sgRNA合成也要達到相當高的產(chǎn)量，方能滿足不同類型基因的編輯需要，擴大試劑盒的應用范圍。翌圣生物sgRNA Synthesis Kit經(jīng)過多個種類的sgRNA的合成，其產(chǎn)量也是很高，可以滿足實驗所需，因此可以適應多種基因的編輯需要。
圖4：不同種類的sgRNA的合成量
在影響CRISPR/Cas9系統(tǒng)的編輯的效果成敗的關鍵因素中，合成的sgRNA的品質也是關鍵一環(huán)。因為合成的sgRNA的純度（即品質）不好，對編輯的效率會產(chǎn)生很大影響。翌圣生物sgRNA Synthesis Kit所合成的sgRNA經(jīng)過安捷倫2100測定，其純度單一，說明品質較高，對后續(xù)的編輯效率會有很大提升。
圖5：合成的sgRNA的品質（安捷倫2100測定）
最后，所合成的高品質sgRNA是否有活性，需要實地測定才能發(fā)現(xiàn)其是否有活性，是否能夠與Cas9 Nuclease進行組合達到編輯基因的目的。翌圣生物sgRNA Synthesis Kit所合成的sgRNA與Cas9 Nuclease進行組合體外切割靶DNA，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測發(fā)現(xiàn)所合成的sgRNA可以有效引導Cas9 Nuclease在特定位點切割并產(chǎn)生特定大小的DNA片段，因此具備活性。
圖6：sgRNA的剪切效率效果圖
翌圣生物為您提供高品質、高性價比的sgRNA合成試劑盒，讓您的CRISPR/Cas9科學研究及相關基因編輯應用如虎添翼，共同為人類的未來健康奉獻一份力量。
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產(chǎn)品名稱 | 貨號 | 規(guī)格 |
Hifair® Precision sgRNA Synthesis Kit | 11355ES50/60 | 50/100T |
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Hieff Trans™ siRNA/miRNA 體外轉染試劑 | 40806ES02/03 | 0.5/1 mL |
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【1】王晗月,楊曉菲,胡巢鳳,李富榮. CRISPR/Cas9基因編輯技術在糖尿病細胞治療中的應用研究進展[J]. 生命科學,2019,07:723-73.
【2】Lone BA, Karna SKL, Ahmad F, Shahi N, Pokharel YR. CRISPR/Cas9 System: A Bacterial Tailor for Genomic Engineering. Genet Res Int. 2018;2018:3797214. Published 2018 Sep 18. doi:10.1155/2018/3797214.
