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DNA聚合酶的選擇是聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)中的重要決策之一，相較于準(zhǔn)確度需求較低的菌落PCR等分析實(shí)驗(yàn)，蛋白表達(dá)、突變檢測(cè)、基因篩選等準(zhǔn)確度要求較高的實(shí)驗(yàn)，則需要選擇高保真DNA聚合酶，以保證擴(kuò)增過(guò)程中的保真度。
什么是DNA聚合酶的保真度
DNA聚合酶的保真度指的是其進(jìn)行準(zhǔn)確擴(kuò)增模板的能力，確保DNA序列的高度準(zhǔn)確擴(kuò)增。高保真酶具有3'到5'核酸外切酶的活性，可對(duì)聚合反應(yīng)時(shí)錯(cuò)配的堿基進(jìn)行切除，從而保證擴(kuò)增的準(zhǔn)確性。
錯(cuò)配率是高保真DNA聚合酶保真性的一個(gè)通用標(biāo)準(zhǔn)，錯(cuò)配率越低保真性越好。保真度常用錯(cuò)配率的倒數(shù)表示（保真度=1/錯(cuò)配率）。
圖1. 高保真酶作用原理圖（源于網(wǎng)絡(luò)）
如何測(cè)定DNA聚合酶的保真度
常見(jiàn)的DNA聚合酶測(cè)定方法有藍(lán)白斑篩選測(cè)定、一代測(cè)序和NGS測(cè)序等。
◎ 藍(lán)白斑篩選測(cè)定
原理：利用DNA聚合酶擴(kuò)增lacZ基因，基于lacZ基因的α-互補(bǔ)性，它能還原β-半乳糖苷酶基因活性，并產(chǎn)生藍(lán)色菌落，結(jié)合藍(lán)白斑篩選評(píng)估保真度。
操作步驟：用DNA聚合酶擴(kuò)增lacZ基因，將PCR產(chǎn)物連接到載體上，轉(zhuǎn)化，藍(lán)白斑篩選。若lacZ基因存在錯(cuò)誤，則破壞β-半乳糖苷酶活性，菌落呈現(xiàn)白色，白斑克隆的比例可轉(zhuǎn)化為錯(cuò)誤摻入的數(shù)量。
操作步驟：根據(jù)DNA模板設(shè)計(jì)PCR擴(kuò)增引物；利用DNA聚合酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增；將PCR產(chǎn)物克隆至載體上，挑取單菌落進(jìn)行大規(guī)模Sanger測(cè)序，計(jì)算發(fā)生錯(cuò)配的核苷酸數(shù)與聚合的總核苷酸數(shù)的比值（錯(cuò)配率）。
◎ NGS測(cè)序
操作步驟：根據(jù)DNA模板設(shè)計(jì)PCR擴(kuò)增引物；利用DNA聚合酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增；將PCR產(chǎn)物利用NGS平臺(tái)對(duì)DNA分子進(jìn)行雙向測(cè)定，篩選正反兩個(gè)方向均有效的數(shù)據(jù)，在突變的判定過(guò)程中，正反兩個(gè)方向均測(cè)定出突變的位置記為一次突變，此突變屬于DNA聚合酶引入的突變；如測(cè)定只有一個(gè)方向測(cè)定出現(xiàn)突變，另一個(gè)方向測(cè)定無(wú)突變，則該突變?yōu)闇y(cè)序平臺(tái)引入的突變，不屬于DNA聚合酶擴(kuò)增引入的突變，計(jì)算DNA聚合酶擴(kuò)增過(guò)程中引入的突變/有效DNA測(cè)序量（保真度）[1]。
提示：在PCR擴(kuò)增中，不同的序列引入突變的概率是有差異的，一般研究人員選擇為多個(gè)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序比較，擴(kuò)增的目的基因序列在設(shè)置在容易導(dǎo)入基因突變的富含GC 序列區(qū)域以及重復(fù)等區(qū)域。
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高保真酶檢測(cè)方法有很多，不同品牌的高保真酶的測(cè)定方法不同，一般保真性測(cè)定會(huì)是相對(duì)于Taq DNA聚合酶比較，來(lái)判斷DNA聚合酶的保真性。
翌圣生物Hieff Canace® Gold 高保真DNA聚合酶通過(guò)藍(lán)白斑篩選測(cè)定方法，測(cè)定其保真性是Taq酶的52倍，Pfu酶的6倍。
圖2. Hieff Canace® Gold 高保真DNA聚合酶的保真性是Taq酶的52倍，pfu酶的6倍。
Canace® Gold 高保真DNA聚合酶除了保真性能外，還有延伸速度快、靈敏度高、適用性廣等特點(diǎn)。
延伸速度可達(dá)15sec/kb,極速可達(dá)1sec/kb
圖3. Hieff Canace® Gold高保真DNA聚合酶分別擴(kuò)增小鼠gDNA 2 kb和水稻gDNA 3 kb片段。不同延伸速度（1-60 sec/kb）都可有效擴(kuò)增。M：1kb DNA Marker。
靈敏度高,可擴(kuò)增低至1pg模板
圖4. Hieff Canace® Gold高保真DNA聚合酶擴(kuò)增質(zhì)粒3 kb片段，不同模板量（1 pg-0.5 μg）都可有效擴(kuò)增。NC：陰性對(duì)照。M：1kb DNA Marker。
適用于不同GC含量片段的擴(kuò)增
圖5. Hieff Canace® Gold高保真DNA聚合酶對(duì)不同GC含量（30-70%）片段都可高效率的進(jìn)行擴(kuò)增。M：1kb DNA Marker。
訂購(gòu)信息
產(chǎn)品名稱(chēng) | 貨號(hào) | 規(guī)格 |
Hieff Canace® Gold High-Fidelity DNA Polymerase 高保真DNA聚合酶 | 10148ES60/80 | 100 U/500 U |
2 × Hieff Canace® Gold PCR Master Mix 高保真酶預(yù)混液 | 10149ES03/08 | 1 mL/5×1 mL |
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參考文獻(xiàn)：
[1] 王金. 一種檢測(cè)DNA聚合酶保真度的方法:, CN106701896A[P]. 2017.
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