干貨 | 你對“全能選手"DNase I 了解多少？
脫氧核糖核酸酶I（Deoxyribonuclease I, DNase I），是一種可以消化單鏈或雙鏈DNA的非特異性核酸內(nèi)切酶。它能夠水解磷酸二酯鍵，產(chǎn)生含有5'-磷酸基團和3'-OH基團的單脫氧核苷酸和寡脫氧核苷酸。DNase I最佳的工作pH范圍是7-8，其活性依賴于Ca2+，并可被二價金屬離子如Mn2+，Mg2+，Zn2+等激活。在Mg2+存在條件下，DNase I 隨機剪切雙鏈DNA的任意位點；Mn2+存在條件下，DNase I可在同一位點剪切DNA雙鏈，形成平末端，或1-2個核苷酸突出的粘末端。
圖1：DNase I在Mg2+以及Mn2+存在下可切割dsDNA原理圖常見的DNase I主要從牛胰腺中純化或為重組酶。與從牛胰腺中純化的DNase I相比，重組酶來源的內(nèi)源性RNase水平相對較低或者能夠制備成無RNase產(chǎn)品形式，更適合對RNase敏感的應用，如從RNA樣品中去除DNA。提到應用，DNase I除了大家熟知的用于維護RNA完整性相關(guān)實驗，如提取不含DNA的RNA，反轉(zhuǎn)錄前制備無gDNA的RNA模板以及體外轉(zhuǎn)錄后降解DNA模板外，還可用于rRNA去除中消化DNA探針，缺口平移進行DNA標記，足跡法分析DNA-蛋白質(zhì)相互作用，生成隨機的DNA文庫，減少細胞裂解物或蛋白提取物的粘性，在細胞培養(yǎng)過程中作為添加物來消化細胞間的粘連，在細胞凋亡TUNEL檢測中部分剪切基因組DNA作為陽性對照等。綜上所述，DNase I幾乎可用于任何需要酶切DNA的應用中。下面小編簡單介紹幾種常見的應用。RNA作為實驗室常研究的樣本，其質(zhì)量的高低很大程度上會直接影響實驗數(shù)據(jù)的質(zhì)量。一般在RNA提取過程中無法*避免gDNA殘留，因此，在進行具有挑戰(zhàn)性的下游應用（例如mRNA表達量分析，轉(zhuǎn)錄組分析等）之前，通常建議對RNA樣本進行DNase I處理，消化殘留的gDNA。消化gDNA步驟可以在RNA提取期間、RNA提取后或者RNA反轉(zhuǎn)錄之前進行。表1：RNA提取或反轉(zhuǎn)錄前去除DNA相關(guān)產(chǎn)品列表 | | |
| TRIeasyTM 總RNA提取試劑（同Trizol） | |
| MolPure® Cell/Tissue Total RNA Kit 細胞/組織總RNA提取試劑盒 | |
| MolPure® Plant Plus RNA Kit 多糖多酚植物RNA提取試劑盒 | |
| MolPure® Viral DNA/RNA Kit 病毒DNA/RNA提取試劑盒 | |
| Recombinant DNase I (RNase-free) | |
| Hifair® Ⅲ1st Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR (gDNA digester plus) | |
| Hieff UNICON® Universal Blue qPCR SYBR Master Mix | |
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| Hieff Canace® Plus High-Fidelity DNA Polymerase高保真酶 | |
| Hieff Clone® Universal One Step Cloning Kit 無縫克隆試劑盒 | |
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| Hifair® T7 High Yield RNA Synthesis Kit | |
| UCF.ME® T7 RNA Polymerase GMP-grade（50 U/μL） | |
| T7 RNA polymerase (50 U/μL) | |
| NTP Set Solution (ATP, CTP, UTP, GTP, 100 mM each） | |
| UCF.ME® Pyrophosphatase,Inorganic GMP-grade | |
| UCF.ME® Murine RNase inhibitor GMP-grade | |
| UCF.ME® Deoxyribonuclease I (DNase I) GMP-grade | |
| UCF.ME® mRNA Vaccinia Capping Enzyme GMP-grade | |
| UCF.ME® mRNA Cap 2′-O-Methyltransferase GMP-grade | |
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| S-adenosylmethionine (SAM)（32mM） | |
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1.提取Total RNA；
2.單鏈DNA探針和rRNA分子雜交結(jié)合（注：需要設(shè)計與合成rRNA 特異性單鏈 DNA 探針）；
3.RNase H降解雜交的rRNA；
4.DNase I降解DNA 探針；
5.rRNA被成功去除，剩下非rRNA的RNA模板。
表3：rRNA去除相關(guān)產(chǎn)品列表 | | |
| Hieff NGS® MaxUp rRNA Depletion Kit (Human/Mouse/Rat) MaxUp核糖體RNA去除試劑盒(人/小鼠/大鼠) | |
| Hieff NGS® MaxUp rRNA Depletion Kit (Plant) MaxUp核糖體RNA去除試劑盒(植物) | |
| Hieff NGS® MaxUp Human rRNA Depletion Kit （rRNA & ITS/ETS） MaxUp核糖體RNA去除試劑盒（Human rRNA&ITS/ETS） | |
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| Recombinant DNase I (RNase-free) | |
1.先用適宜濃度的DNase I在待標記的雙鏈DNA的每一條鏈上產(chǎn)生若干個單鏈缺口，缺口處形成3’羥基末端。
2.再用E.coli DNA Polymerase I的5’→3’外切酶活性從缺口處5’端切除一個核苷酸，同時E.coli DNA Polymerase I的5’→3’聚合酶活性將一個帶標記的核苷酸引入到缺口的3'端，以修補缺口，隨著缺口在DNA鏈上的移動，標記的核苷酸就摻入到新合成的DNA鏈中。
表4：缺口平移法進行DNA標記相關(guān)產(chǎn)品列表 | | |
| Deoxyribonuclease I (DNase I) from bovine pancreas | |
| Recombinant DNase I (RNase-free) | |
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1.將待檢雙鏈DNA分子進行單鏈末端標記。
2.將蛋白質(zhì)和DNA混合后，加入適量的DNase I進行酶切，形成不同長度的DNA片段。該過程需要控制酶的用量，最好保證相鄰的DNA片段只相差一個核苷酸，并列設(shè)置未加蛋白質(zhì)的對照。
3.從DNA上除去蛋白質(zhì)，將變性的DNA用PAGE電泳分離，放射自顯影，與對照組相比后解讀出足跡部位的核苷酸序列。
常見應用：轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋白通過與啟動子區(qū)域結(jié)合來調(diào)控靶標基因的轉(zhuǎn)錄。相關(guān)實驗：凝膠阻滯實驗（EMSA）。EMSA可以確定蛋白是否與DNA直接結(jié)合，而DNase I足跡法分析實驗則可以精確鑒定其結(jié)合的DNA序列。
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| Deoxyribonuclease I (DNase I) from bovine pancreas 脫氧核糖核酸酶I，來源于牛胰腺（CAT#10607，10608） | | 主要應用于蛋白質(zhì)研究: 從蛋白制備物中去除 DNA。 |
| Recombinant DNase I (RNase-free)（CAT#10325） | | 適用于各種應用：從 RNA 和蛋白制備物中去除 DNA，如對RNase敏感的cDNA文庫或用于RT-PCR實驗樣品制備。 |
| UCF.ME® Deoxyribonuclease I (DNase I) GMP-grade（CAT#10611） | 無RNase殘留，GMP藥用級別。采用藥用規(guī)格原輔料生產(chǎn)，符合GMP規(guī)范的產(chǎn)品生產(chǎn)與質(zhì)量管理規(guī)程保障生產(chǎn)過程及所有原輔料可追溯。 | 適用于各種應用：從 RNA 和蛋白制備物中去除 DNA，如對RNase敏感的cDNA文庫或用于RT-PCR實驗樣品制備。 |
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