越來越多的神經類疾病未被攻克，威脅著人類的健康，所以認識大腦的全部功能并能治療各種神經類疾病是每個神經類科研工作者致力的方向。涉及現(xiàn)實和倫理方面的限制，想要獲取實驗使用的腦組織存在困難，傳統(tǒng)上常使用某些多如嚙齒類動物作為模式生物，用于神經科學的研究。但是，人和嚙齒類動物的腦組織結構和發(fā)育相似度并不是很高，因此在體外培養(yǎng)腦類器官是一件非常急需解決的問題。

科研人員可以通過分化人多能干細胞（hPSCs），包括誘導多能干細胞（ips）和胚胎干細胞（ES），來獲取神經細胞，在體外模擬人的環(huán)境，培養(yǎng)出腦類器官，有利于研究者發(fā)展治療手段，從而治愈疾病。

研究團隊開發(fā)了一種將人類多能干細胞分化為表達人類中腦特征標志物的神經元細胞層的方法，將患者的皮膚成纖維細胞重編程為iPSCs，然后置于添加FGF-basic（堿性成纖維細胞因子）、CHIR-99021，MEK抑制劑（PD0325901）的培養(yǎng)基中培養(yǎng)。

DMEM/F12的神經元誘導培養(yǎng)基：神經基礎、1：100 N2、1：50 B27去除維生素A、1% 谷氨酰胺、10 μM SB-431542、200 ng/mL Noggin、0.8 μM CHIR-99021和10 μM ROCK抑制劑Y-27632、0.1% β-巰基乙醇、1 μg/mL肝素。前48 h加入Y-27632，第2天改變神經元誘導培養(yǎng)基。

3天后，hMLOs開始擠壓神經外胚層芽。此時，培養(yǎng)基被移除，并立即使用配備預冷200 μL移液管的移液管向每個孔中加入30 μL還原生長因子基質凝膠。將基質嵌入的中腦類器官放入37°C培養(yǎng)箱30 min，使基質凝固。

生長在組織生長誘導培養(yǎng)基中含有神經基礎培養(yǎng)基，1：100 N2、1：50 B27去除維生素A、1% 谷氨酰胺、0.1% β巰基乙醇、2.5 μg/mL胰島素、200 ng/mL層粘連蛋白、100 ng/mL SHH-C25II和100 ng/mL FGF8。

分化培養(yǎng)基，包括神經基礎培養(yǎng)基、1：100 N2、1：50 B27去除維生素A、1% 谷氨酰胺、100 μM抗壞血酸、125 μM DBcAMP、0.1% β巰基乙醇、10 ng/mL BDNF，10 ng/mL GDNF。培養(yǎng)基中加入了雙抗，以防止長期培養(yǎng)過程中潛在的細菌污染。每3天更換一次培養(yǎng)基。[1]

圖1.人中腦樣類器官每個階段細胞的典型形態(tài)（SBNC：SB-431542、CHIR-99021、Noggin）[1]

圖2.神經元免疫染色[1]

額顳葉癡呆是一種非常嚴重的神經系統(tǒng)疾病，會導致患者的行為、言語和思考出現(xiàn)問題。已知tau蛋白的突變和該疾病息息相關，但是具體的作用機制并不十分清楚。因此，研究團隊利用人源誘導多能干細胞（induced pluripotent stem cell，iPSC）在體外構建了額顳葉癡呆的大部分損傷的大腦類器官模型，表達tau突變蛋白，從而揭示神經元損傷的早期的分子水平變化，闡述致病機理，并發(fā)現(xiàn)一種藥物Apilimod能抑制神經元的死亡。

球形形成培養(yǎng)基（SFM）：E8培養(yǎng)基和10 mM ROCK抑制劑Y-27632組成。

分化培養(yǎng)基由E6培養(yǎng)基添加2.5 mM Dorsomorphin、10 mM SB-431542和2.5 mM XAV-939；每個球狀體添加1 mL培養(yǎng)基。將球狀體輕輕混合，在37℃和5%二氧化碳下孵育48小時。

每天從培養(yǎng)皿中輕輕吸出培養(yǎng)基，用分化培養(yǎng)基替換，從第2天到第5天實現(xiàn)65%培養(yǎng)基交換。第6天，將培養(yǎng)基改為神經培養(yǎng)基（NM），包括神經基底、B27去除維生素A、谷氨酸和抗A，并添加20 ng/mL EGF+20 ng/mL FGF2。

第25天，每隔一天用NM補充20 ng/mL BDNF和20 ng/mL NT3（培養(yǎng)基C），補充65%培養(yǎng)基。從第43天開始，每3-4天更換一次培養(yǎng)基，不添加生長因子，每個培養(yǎng)皿更換15-20 mL，75%培養(yǎng)基更換。在整個培養(yǎng)期間，融合在一起的類器官被一次性手術刀切割分開。在下圖的實驗中，誘導多能干細胞被生長和模式化。[2]

圖3.腦類器官中神經元存活的縱向軸[2]

圖4. 5 mM谷氨酸處理tau-V337M和等位基因V337V類器官圖像[2]

圖5.5 mM谷氨酸鹽和DMSO處理tau-V337M類器官圖像[2]

 圖6.apilimod可逆轉tau-V337M類器官對谷氨酸興奮毒性的敏感性[2]

人類大腦發(fā)育表現(xiàn)出幾個的方面，如復雜性的增加和神經元輸出的擴大，已被證明很難在模式生物中進行研究。因此，體外方法模擬人類大腦發(fā)育和疾病是一個熱門的研究領域。

在這里，研究團隊建立了類腦器官培養(yǎng)模型，能模仿內源性發(fā)育程序，該模型能在標準組織培養(yǎng)室內進行培養(yǎng)，在1~2個月內即可發(fā)育出大腦皮層、腹側端腦、視網膜等。這個方案可以應用于發(fā)育研究以及各種人類大腦疾病的研究。

此外，由于類器官可以在長期培養(yǎng)中維持一年以上，它們也有可能模擬后期事件，如神經元成熟和存活。

人多能干細胞產生大腦類器官：添加L-alanyl-L-glutamine solution、ROCK抑制劑Y-27632、N-2 supplement、B27去除維生素A、B27+vitA supplement、Penicillin-Streptomycin、bFGF等。[3]

圖7.人PSCs腦類器官發(fā)育的進展[3]

腦類器官培養(yǎng)添加的化合物匯總：

[1] Jo J, et al. Midbrain-like Organoids from Human Pluripotent Stem Cells Contain Functional Dopaminergic and Neuromelanin-Producing Neurons. Cell Stem Cell. 2016 Aug 4;19(2):248-257. doi: 10.1016/j.stem.2016.07.005. Epub 2016 Jul 28. PMID: 27476966; PMCID: PMC5510242.

[2] Bowles K R, et al. ELAVL4, splicing, and glutamatergic dysfunction precede neuron loss in MAPT mutation cerebral organoids[J]. Cell, 2021(Suppl 5).

[3] Lancaster M A, Knoblich J A. Generation of cerebral organoids from human pluripotent stem cells[J]. Nature protocols erecipes for researchers, 2014.