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近年來，mRNA疫苗/藥物逐漸走入大眾的視野。mRNA疫苗/藥物具有設計快速、成本低和易于規(guī)?；a(chǎn)的優(yōu)點，但由于mRNA本身易降解，目前主要通過加帽加尾的方式提高mRNA制劑的穩(wěn)定性，并輔助mRNA的翻譯。近年來，研究者們在多種生物中發(fā)現(xiàn)了一種新型RNA——環(huán)狀RNA(circular RNA, circRNA)，此類RNA呈共價閉合環(huán)狀結構，不易被核酸外切酶降解，較mRNA更加穩(wěn)定，且可以實現(xiàn)非帽依賴蛋白質(zhì)翻譯。因此circRNA的發(fā)現(xiàn)為開發(fā)新一代生產(chǎn)工藝更簡單、穩(wěn)定性更好和時效更長的RNA疫苗及藥物提供可能。
圖1 ：RNA疫苗作用過程[1]
circRNA生產(chǎn)過程包括：模板制備、體外轉錄、DNA模板去除、環(huán)化和純化。在RNA環(huán)化后需要用核糖核酸酶R (Ribonuclease R, RNase R)對未環(huán)化的RNA進行消化，達到富集circRNA的目的。當前主流使用的RNase R主要為進口品牌，存在價格高、貨期久等問題，不適合用于大批量生產(chǎn)。翌圣擁有雙向分子酶理性設計與定向進化平臺和專門為GMP級別產(chǎn)品打造的分子酶生產(chǎn)基地，從硬件和軟件上同時保證產(chǎn)品的品質(zhì)。經(jīng)過對蛋白質(zhì)結構進行理性設計和基于超高通量單細胞分選技術的定向進化，翌圣研發(fā)團隊成功開發(fā)出一款純度高、消化活性強的RNase R產(chǎn)品，為新一代RNA疫苗/藥物上市提供助力！
翌圣生物RNase R（Cat#14606ES）是一種來源于大腸桿菌的Mg2+依賴性3'→5'核糖核酸外切酶，它能消化所有的線性RNA，不易消化circRNA、套索RNA或3’端突出末端少于7 個核苷酸的雙鏈RNA分子，常用于去除線性RNA分子，實現(xiàn)富集circRNA和套索RNA等非線性RNA的目的。
蛋白純度（SDS-PAGE）≥95%；
無核酸外切酶殘留；
與A進口品牌RNase R產(chǎn)品消化線性RNA能力相當；
與A進口品牌RNase R產(chǎn)品對circRNA富集作用相當。
蛋白純度（SDS-PAGE）≥95%
圖2：蛋白純度檢測：使用SDS-PAGE技術檢測產(chǎn)品的蛋白純度，從左到右依次為相同產(chǎn)品濃度下不同體積（1 μL，2 μL，3 μL）的結果，結果表明翌圣RNase R（Cat#14606ES）產(chǎn)品蛋白純度≥95%。
無核酸外切酶殘留
圖3：核酸外切酶殘留檢測：將20 U 翌圣RNase R加入到 0.5 μg λDNA- Hind Ⅲ digest中，于37℃孵育4小時，之后進行瓊脂糖凝膠電泳 ，結果顯示DNA 條帶未發(fā)生變化，說明翌圣RNase R（Cat#14606ES）產(chǎn)品無核酸外切酶殘留。
與A進口品牌RNase R產(chǎn)品消化線性RNA能力相當
圖4：翌圣RNase R（Cat#14606ES）產(chǎn)品與A進口廠家RNase R產(chǎn)品消化線性RNA能力比較：將翌圣RNase R（Cat#14606ES）產(chǎn)品與A進口廠家RNase R產(chǎn)品分別投入含有線性RNA底物的反應體系中進行反應，結果顯示當RNase R產(chǎn)品的投入量達到2-4 U時，可觀察到RNA條帶變微弱甚至消失，表明RNase R對線性RNA分子具有消化作用，且翌圣RNase R（Cat#14606ES）產(chǎn)品與A進口廠家RNase R產(chǎn)品對線性RNA分子的消化能力相當。
與A進口品牌RNase R產(chǎn)品對circRNA富集作用相當
圖5：翌圣RNase R（Cat#14606ES）產(chǎn)品與A進口廠家RNase R產(chǎn)品對circRNA的富集作用比較：將翌圣（Cat#14606ES）產(chǎn)品與A進口廠家RNase R產(chǎn)品分別投入含有circRNA底物的反應體系中進行反應，結果顯示經(jīng)過翌圣RNase R（Cat#14606ES）產(chǎn)品與A進口廠家RNase R產(chǎn)品處理后的RNA條帶亮度基本無差別，表明circRNA能耐受RNase R的消化。以上結果證實翌圣（Cat#14606ES）產(chǎn)品與A進口廠家RNase R產(chǎn)品均能有效用于circRNA富集。
翌圣RNase R對線性RNA的切割效果優(yōu)于其他品牌
圖6：翌圣（Cat#14606ES）產(chǎn)品與廠家A和B的RNase R消化線性mRNA分子效果比較：將翌圣RNase R（Cat#14606ES）產(chǎn)品與廠家A和B的RNase R產(chǎn)品分別投入含有1 μg 線性mRNA底物的反應體系中進行反應，結果顯示翌圣RNase R（Cat#14606ES）產(chǎn)品對線性RNA的消化效果優(yōu)于廠家A和B的RNase R。(數(shù)據(jù)來源于深圳**客戶)
產(chǎn)品名稱 | 產(chǎn)品貨號 | 產(chǎn)品規(guī)格 |
RNase R (20 U/μL) | 14606ES | 250U/2500U/10000U |
T7 RNA Polymerase GMP-grade (50 U/μL) | 10624ES | 5000U/50000U |
T7 RNA Polymerase GMP-grade (250 U/μL) | 10625ES | 10KU/100KU/2500KU/100MU |
mRNA Vaccinia Capping Enzyme GMP-grade (10 U/μL) | 10614ES | 2000U/10000U/100000U/5MU |
mRNA Cap 2′-O-Methyltransferase GMP-grade (50 U/μl) | 10612ES | 10KU/50KU/250KU/20MU |
Pyrophosphatase, Inorganic GMP-grade (1 U/μL) | 10620ES | 10 U/100U/1000U/40KU |
Deoxyribonuclease I (DNase I) GMP-grade (2 U/μL) | 10611ES | 500U/2000U/10000U |
Murine RNase inhibitor GMP-grade (40 U/μL) | 10621ES | 10KU/20KU/100KU/1MU |
參考文獻：
Qu L, Yi Z, Shen Y, et al. Circular RNA vaccines against SARS-CoV-2 and emerging variants. Cell. 2022;185(10):1728-1744.e16. doi:10.1016/j.cell.2022.03.044
Chen L, Wang C, Sun H, et al. The bioinformatics toolbox for circRNA discovery and analysis. Brief Bioinform. 2021;22(2):1706-1728. doi:10.1093/bib/bbaa001
