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酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定，又稱酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)，即ELISA，是酶免疫測(cè)定技術(shù)中應(yīng)用的技術(shù)。1971年Engvall等人發(fā)表了使用ELISA定量測(cè)定IgG的文章，將1966年用于抗原定位的酶標(biāo)抗體技術(shù)發(fā)展成液體標(biāo)本中微量物質(zhì)的測(cè)定方法。
ELISA原理是將抗原或抗體包被在固相載體上，利用抗原抗體特異性結(jié)合，檢測(cè)過(guò)程中，通常使用洗板的方式去除非結(jié)合物，最終酶促反應(yīng)后的底物的顏色，對(duì)樣本中蛋白進(jìn)行定性與定量。
1.抗體：單抗特異性強(qiáng)，多抗結(jié)合性高，試劑盒需要高效的配對(duì)。
2.抗原：大多為重組蛋白,細(xì)胞因子和待測(cè)樣本，高效標(biāo)準(zhǔn)品需NIBSC/WHO校準(zhǔn)。
3.顯色作用體系：首先辣根過(guò)氧化物酶（HRP）與常見底物TMB和OPD均可形成顯色體系，再者堿性磷酸酶(AP)的底物為對(duì)-硝基苯磷酸酯可形成黃色底物，還有葡萄糖氧化酶（GOD）的葡萄糖氧化酶法形成特殊顯色，最后β-D-半乳糖苷（β-D-Gal）的底物為4-甲基傘酮基β-D半-乳糖苷（4MUG）可生成高強(qiáng)度熒光。
圖1：ELISA常用試劑示意圖
根據(jù)試劑的來(lái)源和樣本的情況以及檢測(cè)的具體條件，可設(shè)計(jì)出各種不同類型的檢測(cè)方法，按照原理及操作，市面的方法有：
是檢測(cè)抗體的方法，原理為利用酶標(biāo)記的二抗以檢測(cè)已與固相結(jié)合的受檢抗體，顯色測(cè)定。優(yōu)勢(shì)在于待測(cè)一抗無(wú)需標(biāo)記快速便捷。直接法ELISA與間接法ELISA相似，區(qū)別在于一抗酶標(biāo)，檢測(cè)孵育也以抗原為主，但直接法ELISA的靈敏度有限，需權(quán)衡使用。
圖2：間接法ELISA示意圖
又分為雙抗原夾心法和雙抗體夾心法ELISA，原理相似，用于檢測(cè)抗體或抗原含量。以雙抗體夾心法為例，捕獲抗體包被在固相載體上，加入抗原或待測(cè)樣本結(jié)合，后加入的檢測(cè)抗體結(jié)合在抗原上，形成三明治夾心形式。雙抗夾心法是市面最常見與方便分析的方法。
圖3：雙抗夾心法ELISA示意圖
小分子抗原與半抗原的檢測(cè)方法常用競(jìng)爭(zhēng)法ELISA，待檢樣本中抗原越多，被結(jié)合的酶標(biāo)抗原的量會(huì)減少，彼此形成競(jìng)爭(zhēng)負(fù)相關(guān)體系，顯色物質(zhì)也就越少，根據(jù)顯色物質(zhì)的比例可擬合得到待測(cè)抗原含量。
圖4：競(jìng)爭(zhēng)法ELISA示意圖
a.免疫抑制法測(cè)ELISA：固相包被抗原，被檢樣本對(duì)底物顯色的抑制程度與樣本中所含抗原的量成正比，二者之差為待測(cè)抗原含量，原理類似與競(jìng)爭(zhēng)法ELISA。
b.阻斷ELISA：目的檢測(cè)特異性抗體，也稱為競(jìng)爭(zhēng)ELISA，原理為固相包被抗原，待測(cè)樣本與一抗酶標(biāo)競(jìng)爭(zhēng)孵育，待檢樣本中抗體越多，顯色越淺，反則反之。非洲豬瘟病毒抗體檢測(cè)試劑盒中涉及該法。
c.此外有用于檢測(cè)IgM抗體的抗體捕捉ELISA，有固相載體改變的Dot-ELISA（硝酸纖維素膜）和C-ELISA（滌綸布），還有技術(shù)分類的TRFIA和多因子檢測(cè)等。
ELISA Kit的多指標(biāo)決定了產(chǎn)品質(zhì)量的優(yōu)劣，優(yōu)秀的試劑盒需要對(duì)如下6大項(xiàng)指標(biāo)進(jìn)行測(cè)定評(píng)估，分析如下：
ELISA Kit的多指標(biāo)決定了產(chǎn)品質(zhì)量的優(yōu)劣，優(yōu)秀的試劑盒需要對(duì)如下6大項(xiàng)指標(biāo)進(jìn)行測(cè)定評(píng)估，分析如下：
a.回收率：測(cè)定試劑盒對(duì)數(shù)據(jù)真實(shí)性的校準(zhǔn)，過(guò)高或偏低會(huì)產(chǎn)生加樣和假性性的失準(zhǔn)數(shù)據(jù)。
b.線性：測(cè)定試劑盒稀釋液與樣本微環(huán)境的的準(zhǔn)確性，過(guò)高或偏低均會(huì)出現(xiàn)測(cè)定的偏差。
a.板內(nèi)精確度：評(píng)價(jià)單次實(shí)驗(yàn)中，同一個(gè)已知濃度不同復(fù)孔的差異。
b.板間精確度：評(píng)價(jià)同一樣本，多次實(shí)驗(yàn)的差異。
低檢測(cè)限：能顯著區(qū)分空白信號(hào)的最小信號(hào)值對(duì)應(yīng)的低濃度，用于評(píng)估試劑盒的靈敏度，值越低試劑盒靈敏度越高。
a.交叉反應(yīng)：評(píng)判特異性，不同分子與試劑盒抗體結(jié)合能力，交叉反應(yīng)越大，特異性越差。
b.抗干擾能力：同源物的干擾，內(nèi)源性物質(zhì)對(duì)檢測(cè)系統(tǒng)的干擾。
對(duì)天然樣本及合適的樣本類型檢測(cè)分析。對(duì)天然樣本類型確定，避免假陽(yáng)性或假陰性結(jié)果。
試劑盒時(shí)效性和穩(wěn)定性是對(duì)指標(biāo)檢測(cè)的重要保障。穩(wěn)定性越高，試劑盒存儲(chǔ)時(shí)間越久。
圖5：ELISA試劑盒產(chǎn)品分類
ELISA技術(shù)是特定靶標(biāo)蛋白質(zhì)定量的金標(biāo)準(zhǔn)，提供快速，穩(wěn)定且易于分析的結(jié)果?？梢詫?duì)生物大分子/小分子的定量，對(duì)親和力測(cè)定評(píng)價(jià)或者篩選，還可對(duì)重組蛋白或細(xì)胞因子進(jìn)行活性比對(duì)分析等運(yùn)用。常應(yīng)用于細(xì)胞因子，趨化因子，生長(zhǎng)因子等檢測(cè)，同時(shí)應(yīng)用于癌癥、干細(xì)胞、免疫學(xué)、神經(jīng)學(xué)和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等研究領(lǐng)域的靶標(biāo)。
圖6：ELISA的技術(shù)應(yīng)用
在生物醫(yī)藥研究，細(xì)菌疾病和臨床診斷中，ELISA作為成熟免疫的檢測(cè)方法定量檢測(cè)出所需研究的細(xì)胞因子，抗原等物質(zhì)，應(yīng)用十分廣泛，了解ELISA并選擇合適的試劑盒，會(huì)讓研究事半功倍。
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