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國(guó)際期刊 ┃ 翌圣克隆試劑盒助力浙大團(tuán)隊(duì)揭示病原菌宿主適應(yīng)新機(jī)制
2023年9月2日，浙江大學(xué)樂(lè)敏課題組在National Science Review（IF=20.600）上發(fā)表研究論文“Genome degradation promotes Salmonella pathoadaptation by remodeling fimbriae-mediated proinflammatory response"，該論文使用翌圣一步法快速克隆試劑盒（Cat#10911）構(gòu)建菌毛基因缺失株，以禽宿主專性病原——雞白痢沙門菌為模型，探究基因組退化促進(jìn)病原菌宿主適應(yīng)的機(jī)制，揭示了病原菌宿主適應(yīng)新機(jī)制。
目前關(guān)于基因組退化在影響病原菌致病行為方面的確切作用知之甚少，潛在的分子細(xì)節(jié)還有待研究。為了探究潛在的進(jìn)化驅(qū)動(dòng)因素，研究人員利用跨越一個(gè)多世紀(jì)的大規(guī)模全球禽類傳染病——限制性雞白痢沙門氏菌（bvSP）為模型，通過(guò)大量的基因組測(cè)序和大數(shù)據(jù)分析，證實(shí)了雞白痢沙門菌在我國(guó)內(nèi)普遍存在，特別是在華東地區(qū)影響較大。研究發(fā)現(xiàn)，我國(guó)雞白痢沙門菌耐藥情況十分嚴(yán)峻，雞白痢沙門菌分離株對(duì)多種抗菌藥表現(xiàn)出高度耐藥性，高達(dá)97.29%的分離株對(duì)喹諾酮類藥物高耐受。其中，抗微生物藥物的基因型ST92在中國(guó)雞群中越來(lái)越普遍。
本研究中，研究人員通過(guò)對(duì)全球458個(gè)bvSP基因組測(cè)序和大數(shù)據(jù)分析，構(gòu)建了雞白痢沙門菌的系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果表明該菌株可分化為3個(gè)譜系，L1為祖先分支，L2和L3是逐步流行演化出的兩個(gè)分支，且最近出現(xiàn)的兩個(gè)譜系（L2/L3）的毒力增強(qiáng)。與中國(guó)一樣，世界范圍內(nèi)主要優(yōu)勢(shì)型基因也為ST92。值得注意的是，最近分離的菌株攜帶更多的耐藥基因和質(zhì)粒。
雞白痢沙門菌逐步增強(qiáng)毒性的進(jìn)化（圖片來(lái)自原文）
研究人員通過(guò)雛雞與雞胚感染試驗(yàn)和體外不利環(huán)境的模擬，發(fā)現(xiàn)雞白痢沙門菌在進(jìn)化過(guò)程中毒力逐漸增強(qiáng)，但對(duì)外界環(huán)境的生存能力逐漸下降；通過(guò)泛基因組分析精確地指出該菌的進(jìn)化伴隨著基因的缺失，即來(lái)自毒力譜系的菌毛退化。
集約化養(yǎng)殖和毒性克隆的出現(xiàn)（圖片來(lái)自原文）
為了進(jìn)一步探究菌毛基因的缺失與菌株進(jìn)化的關(guān)系，研究人員利用CRISPR/Cas9協(xié)同同源重組技術(shù)構(gòu)建了多個(gè)菌毛基因缺失株，通過(guò)親本與突變株的差異比較發(fā)現(xiàn)，菌毛功能的丟失限制了糞口途徑的水平傳播，但增強(qiáng)了雞白痢沙門菌的毒力。研究結(jié)果表明，bvSP通過(guò)菌毛功能的缺失減緩了宿主的促炎反應(yīng)以實(shí)現(xiàn)免疫逃逸，同時(shí)通過(guò)增強(qiáng)雞白痢沙門菌經(jīng)卵途徑的垂直傳播，在我國(guó)集約化養(yǎng)殖模式的助推下形成高毒力且高傳播力的克隆。證明了的毛狀附屬物是如何改變致病性的行為。強(qiáng)調(diào)了在農(nóng)業(yè)集約化過(guò)程中，宿主限制病原體的毒力和傳播是一種新的進(jìn)化增強(qiáng)，為指導(dǎo)我國(guó)禽類流行病的控制和治療提供新的思路和科學(xué)依據(jù)。
（截圖來(lái)自原文）
產(chǎn)品定位 | 產(chǎn)品名稱 | 產(chǎn)品貨號(hào) | 規(guī)格 |
單片段一步克隆 | Hieff Clone® Plus One Step Cloning Kit一步法快速克隆試劑盒 | 10911ES20 | 20T |
多片段一步克隆 | Hieff Clone® Universal One Step Cloning Kit | 10922ES20 | 20T |
翌圣一步法快速克隆試劑盒是一種利用同源重組的原理，進(jìn)行無(wú)縫克隆的技術(shù)。該技術(shù)無(wú)需考慮酶切位點(diǎn)，將PCR產(chǎn)物定向克隆至任何載體的任何位點(diǎn)，可高效克隆50 bp-10 kb片段。操作過(guò)程簡(jiǎn)單快速，只需50°C，20 min即可完成反應(yīng)。勁爆的是，多個(gè)片段也可以同時(shí)克隆哦！
近期的研究表明，6 μL體系，低劑量10 kb載體（40 ng）、1 kb片段（10 ng）條件下，10911ES、10922ES與競(jìng)品相比，依舊具有高性能，且陽(yáng)性克隆率達(dá)100%，結(jié)果如圖1所示。
圖1.使用10911ES、10922ES和競(jìng)品Q進(jìn)行單片段連接，10911ES、10922ES陽(yáng)性率100%
A.重組轉(zhuǎn)化平板圖；B.陽(yáng)性克隆檢測(cè)電泳圖
單片段連接：5,033 bp+1,863 bp
圖2.使用10922ES和競(jìng)品N*進(jìn)行單片段連接，10922ES陽(yáng)性率100%
A.競(jìng)品N*轉(zhuǎn)化平板；B.競(jìng)品N*陽(yáng)性克隆檢測(cè)電泳圖；C.10922ES轉(zhuǎn)化平板；D.10922ES陽(yáng)性克隆檢測(cè)電泳圖
4片段連接：2,853 bp+2,487 bp+227 bp+2,137 bp+331 bp
圖3.使用10922ES進(jìn)行4片段連接
A.10922ES轉(zhuǎn)化平板圖。B.線性化載體與插入片段電泳圖，M1為Yeasen DL5,000；泳道1為片段A（2,487 bp）；泳道2、3為片段C（2,137 bp）；泳道4為線性化載體（2,853 bp）；泳道5為片段B（227 bp）；泳道8為片段D（331 bp）。C.陽(yáng)性克隆檢測(cè)電泳圖，M2為ATG 10 kb，PCR檢測(cè)大小為1,883 bp
單片段連接：8,130 bp+760 bp
圖4.使用10922ES進(jìn)行單片段連接
A.10922ES轉(zhuǎn)化平板圖；B.線性化載體電泳圖，M1為Yeasen GoldBand 1 kb DNA ladder，泳道1、2、3為載體用EcoRI線性化；C.插入片段電泳圖，M2為Vazyme DL2,000 Plus DNA Marker，泳道1、2均為PCR產(chǎn)物；D.酶切檢測(cè)重組載體，M1為1 kb Marker，泳道1、2、3、4均為酶切鑒定陽(yáng)性克隆，泳道1、2為陽(yáng)性克隆
小翌助您克隆過(guò)關(guān)斬將，每天都出好數(shù)據(jù)。更多相關(guān)產(chǎn)品如下表所示，歡迎選購(gòu)！
產(chǎn)品定位 | 產(chǎn)品名稱 | 產(chǎn)品貨號(hào) | 規(guī)格 |
單片段一步克隆 | Hieff Clone® Plus One Step Cloning Kit一步法快速克隆試劑盒 | 10911ES20 | 20T |
多片段一步克隆 | Hieff Clone® Universal One Step Cloning Kit | 10922ES20 | 20T |
兼容TA/平末端克隆連接 | Hieff Clone® Universal Zero TOPO TA/Blunt Cloning Kit | 10906ES20 | 20T |
替代TA連接克隆 | Hieff Clone® Zero TOPO-TA Cloning Kit零背景TOPO-TA克隆試劑盒 | 10907ES20 | 20T |
替代TA連接克隆 | Hieff Clone® Zero TOPO-TA Simple Cloning Kit, MCS-Depleted零背景TOPO-TA克隆試劑盒（不含MCS多克隆酶切位點(diǎn)） | 10908ES20 | 20T |
替代平末端連接克隆 | Hieff Clone® Zero TOPO-Blunt Cloning Kit零背景TOPO-Blunt平末端克隆試劑盒 | 10909ES20 | 20T |
Hieff Clone® Zero TOPO-Blunt Simple Cloning Kit零背景TOPO-Blunt平末端克隆試劑盒（不含MCS多克隆酶切位點(diǎn)） | 10910ES20 | 20T | |
化學(xué)感受態(tài) | Chemically Competent Cell 化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞 | 11801ES80 | 10×100μL |
DH5α Chemically Competent Cell DH5α化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞 | 11802ES80 | 10×100μL | |
BL21 (DE3) Chemically Competent Cell BL21 (DE3)化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞 | 11804ES80 | 10×100μL | |
常規(guī)PCR擴(kuò)增 | 2×Hieff® PCR Master Mix (With Dye) | 10102ES03 | 1mL
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快速PCR擴(kuò)增 | 2×Hieff® Ultra-Rapid HotStart PCR Master Mix (with Dye) | 10157ES03 | 1mL
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5s/kb，保真?？欤ê蠘尤玖希?/span> | 2× Hieff Canace® AdvanceFast PCR Master Mix (With Dye) | 10164ES03 | 1 mL |
高保真83×Taq，隨心擴(kuò) | 2×Hieff Canace® Plus PCR Master Mix (With Dye)高保真酶預(yù)混液 | 10154ES03 | 1 mL |
柱式法核酸提取 | MolPure® Plasmid Mini Kit質(zhì)粒小量提取試劑盒 | 19001ES50 | 50T |
柱式法核酸提取 | MolPure® Endo-free Plasmid Mini Kit無(wú)內(nèi)毒素質(zhì)粒小量提取試劑盒 | 19021ES50 | 50T |
柱式法核酸提取 | MolPure® Endo-free Plasmid Maxi Kit無(wú)內(nèi)毒素質(zhì)粒大量提取試劑盒 | 19036ES10 | 10T |
柱式法核酸提取 | MolPure® Gel Extraction Kit瓊脂糖凝膠回收試劑盒 | 19101ES50 | 50T |
柱式法核酸提取 | MolPure® PCR Purification Kit PCR產(chǎn)物純化試劑盒 | 19106ES50 | 50T |
